１６０８・ｕ—— Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０１２，Ｖｏｌ １６，Ｎｏ．９ 文章编号：１００７—４２８７（２０１２）０９—１６０８—０４ 骨髓胚胎样干细胞的形态结构特征观察 庞荣清 ，张永云 ，邓永丽 ，马丽花 ，何 洁 ，赵 晶 ，潘兴华 ，张成。 （１．成都军区昆明总医院干细胞与组织器官工程研究中心，云南昆明６５００３２｝２．云南农业大学基础实验研究中心， 云南昆明６５０２０１；３．中山大学附属第一医院神经内科，广东广州５１０Ｏ８０） 摘要：目的观察胚胎样干细胞（ＥＬＳｃｓ）的形态结构特征。方法分别采用无血清培养基在明胶包被过的培养 瓶和传统方法在未包被的培养瓶中分离骨髓胚胎样干细胞和问充质干细胞（ＭＳＣｓ），以ＭＳＣｓ为对照，在光学显微镜 下观察ＥＬＳＣｓ的细胞形态，在透射电镜下观察ＥＬＳＣｓ的超微结构，并采用染色体技术分析传代细胞的核型。结果 与ＭＳＣｓ相比，ＥＬＳＣｓ体积更小、形态纤细均一，传代后细胞贴壁快，在细胞培养瓶中均匀分布生长，不易老化。第四 代ＥＬＳＣｓ的绝大多数细胞膜显示显著的花多样伪足，细胞浆中有丰富的粗面内质网。而部分ＭＳＣｓ的细胞膜光滑， 部分ＭＳＣｓ膜表面有微绒毛，多数细胞胞浆内有空泡和丰富的粗面内质网而且明显扩张形成内质网池，内含中等电子 密度的分泌物。第十代ＥＬＳＣｓ和ＭＳＣｓ都有正常的核型。结论 ＥＬＳＣｓ具有比ＭＳＣｓ更不成熟的细胞形态结构特 征，传代１Ｏ代后细胞仍然是安全的。 关键词：多潜能干细胞；骨髓；超微结构；细胞形态 中图分类号：Ｑ８１３．１ １ 文献标识码：Ａ Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ－ｌｉｋｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ＰＡＮＧ Ｒｏｎｇ— ｑｉｎｇ ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇ—ｙｕｎ．ＤＥＮＧ Ｙｏｎｇ—ｌｉ，ｅｔ ａ１．（１．Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ＆Ｏｒｇａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｋｕｎ— ｕｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ Ａｒｍｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，６５００３２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ．；２．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ６５０２０１，Ｃｈｉ— ｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ Ｙａｔ—ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１００８０，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ—ｌｉｋｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＥＬＳＣｓ） ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＥＬＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｉｎ ｆｌａｓｋ ｃｏａｔｅｄ－ｇｅｌａｔｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈ— ｏｄ．Ｍｏｒｐｈｏｕｓ ｏｆ ＥＬＳＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄ ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＥＬＳＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅｄ ＥＬＳＣｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＭＳＣｓ，ＥＬＳＣｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｓ ｓｍａｌｌ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ１ｙ ｓｌｅｎｄｅｒｅｒ ａｎｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ，ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｐａｓｓａｇｅ，ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｑｕｉｃｋｌｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｔｏ ｆｌａｓｋ ｃｏａｔｅｄ—ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｇｒｅｗ ｗｅｌｌ＿ｄｉｓｔｒ ｕｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｓｋ。ａｎｄ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｍｏｒｅ ｒｅａｄｉｌｙ ａｇｅｉｎｇ．Ｕｎｄｅｒ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｍｏｓｔ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅ ４ ＥＬＳＣｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ ｆｌｏｗｅｒ－ｌｉｋｅ ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉｕｍ ｏｎ ｉｔｓ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ。ａｂｕｎｄａｎｔ ｒｏｕｇｈ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｉｔｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ａｓ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｓｏｍｅ ｐａｓｓａｇｅ ４ ＭＳＣｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ａ ｓｍｏｏｔｈ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ａｎｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ ｏｎ ｉｔｓ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｍａｊｏｒ ＭＳＣｓ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｖａｃ— ｕｏｌｅｓ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｒｏｕｇｈ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｃｉｓｔｅｒｎａｅ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｎｓｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｍａｔｅｒｉａ１．Ｃｈｒｏｍｏ— ｓｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅ １０ ｂｏｔｈ ＥＬＳＣｓ ａｎｄ ＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｎｏｒｍａｌ ｓｔａｔｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＥＬＳＣｓ ｓｈｏｗｅｄ ｍｏｒｅ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｊｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｔｈａｎ ＭＳＣｓ，ｐａｓｓａｇｅ １０ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｓａｆｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ；ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｕｓ． （Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，２０１２，１６：１６０８） 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的不成 熟细胞。自从Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ首次从骨髓组织中分离 到间充质干细胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ） ＭＳＣ其实是一群异质细胞［４］。 最近的研究证实，采用不同的培养方法可以从 骨髓中分离到表达胚胎干细胞抗原标志的干细胞， 并分别被命名为多潜能成体祖细胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ 以来 ］，科学家们发现ＭＳＣｓ具有自我更新和多向 分化的潜能［２。］，在再生医学研究方面具有重要价 ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ，ＭＡＰＣ）Ｌ５］、骨髓来源成体多 潜能诱导细胞（ｍａｒｒｏｗ—ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｄｕｌｔ ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ 值，但采用Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ建立的经典方法获得的 基金项目：云南省自然科学基金面上项目（ＮＯ．２００９ＺＣ１５１Ｍ） ＊通讯作者 ｉｎｄｕｃｉｌｅ ｃｅｌｌ，ＭＩＡＭＩ ｃｅｌ１）Ｌ６］、很小的胚胎样干细胞 （ｖｅｒｙ ｓｍａｌｌ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ—ｌｉｋｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＶＳＥＬ）［ ］等， 为探索改进骨髓干细胞的分离扩增方法进行了有益 虽实验诊断学２０１２年９月第１６卷第９期 １６０９一 的探索。为了方便描述这些表达胚胎干细胞抗原标 胞沉淀液加入０．２５￣ｇ／ｍｌ的秋水仙碱于３７℃孵育 １２０ ｍｉｎ，继而用０．０７５ ｍｏｌ／Ｌ的低渗ＫＣ１溶液裂解 细胞，再用甲醇：冰醋酸固定，低速离心后弃上清，将 细胞沉淀滴片，ＲＨＧ显带处理，Ｇｉｍｅｓａ染色，光学 显微镜下分析拍照。 ２ 结果 志的细胞，参照Ｋｕｃｉａ的命名方法口］，在本文中将表 达胚胎干细胞抗原标志的这些细胞命名为胚胎样干 细胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ－ｌｉｋｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＥＬＳＣｓ）。其中， Ｂａｔｔｕｌａ报道了分离ＥＬＳＣｓ的简便方法 ］，于是我 们尝试分离了ＥＬＳＣｓ，并观察了其形态结构特征。 １材料和方法 ２．１ ＥＬＳＣｓ的形态特征 １．１ 材料 分别采用胚胎干细胞的扩增方法和传统的 ＭＳＣｓ分离方法可以从同一份骨髓中分离到ＥＬＳＣｓ ＤＭＥＭ：／Ｆ１２购自ＨｙＣ１０ｎｅ公司。明胶、２一ｍａｒ－ ｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ购自Ｓｉｇｍａ公司。Ｋｎｏｃｋｏｕｔ－ＤＭＥＭ、ｓｅ— 和ＭＳＣｓ，但在光学显微镜下可见这两种细胞形态 ｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）、ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａ— 存在明显差别。原代ＥＬＳＣｓ体积较小、形态纤细均 ｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ）和新生牛血清（Ｎｅｗｂｏｒｎ ｃａｔｔｌｅ 一（见图１Ａ），传代后细胞贴壁很快，在瓶中均匀分 ｓｅｒｕｍ，ＮＣＳ）均购自ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。碱性成纤维 布生长（见图１Ｂ），更容易扩增，而且传代１Ｏ代后细 细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂＦ— 胞仍然保持细长形态，只是变得更长，增殖活性依然 ＧＦ）购自Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ公司。 较好（见图Ｃ）。而原代ＭＳＣｓ体积较大，常包括纺 １．２ ＥＬＳＣｓ和ＭＳＣｓ的分离培养 锤形、多边性和圆形等多种细胞形态（见图１Ｄ），传 骨髓来自于一名８岁非造血系统疾病男孩，参 代后后两种形态细胞迅速消失，细胞形态变得均一 照Ｂａｔｔｕｌａ报道的方法＿８］，用无血清培养基重悬单个 但比较扁平，传代时细胞贴壁速度明显慢于 核细胞并转移到事先用明胶包被过的培养瓶中静置 ＥＬＳＣｓ，而且细胞常呈丛状分布（见图１Ｅ），长至密 培养以分离扩增ＥＬＳＣ。无血清培养基是添加了 集状态时呈现典型的旋涡状，传代１Ｏ代后的细胞增 ２Ｏ ＳＲ、２ ｍＭ Ｌ—ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ ＮＥＡＡ、０．１ ｍＭ ２一 殖活性明显降低，细胞形态非常扁平，折光性不强， ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏ１和５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ的ｋｎｏｃｋｏｕｔ— 呈现明显的细胞老化现象（见图ＩＦ）。 ＤＭＥＭ培养液。培养瓶的包被：每个培养瓶中加入 ２．２ ＥＬＳＣｓ的超微结构观察 ５ ｍ１ ０．１ 的明胶溶液室温条件下静置３０ ｍｉｎ，然 分别消化收集生长良好的第四代细胞，制成超 后吸弃明胶溶液于室温条件下风干即可。作为对 薄切片，在透射电镜下观察两种细胞的超微结构，可 照，用含血清培养基重悬单个核细胞并转移到未包 见ＥＬＳＣｓ的一个突出特点是绝大部分细胞膜表面 被的培养瓶中静置培养以分离扩增ＭＳＣ。含血清 有十分显著的伪足（见图２Ａ），呈花朵状形态（见图 培养基为含１Ｏ ＮＣＳ的ＤＭＥＭ，／Ｆ１２培养液。光 ２Ｂ，Ｂ１），少数细胞的细胞膜仅形成少量微绒毛样突 学显微镜下观察细胞生长情况并拍照。每４天换 起（见图２Ａ）；细胞胞浆内空泡较少或没有，有丰富 液，到细胞生长至８Ｏ 融合状态时，用ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤ— 的粗面内质网，但不扩张（见图２Ｂ，Ｂ２）。与之不同 ＴＡ消化传代细胞。 的是有的ＭＳＣｓ细胞膜光滑无突起（见图２Ｃ），有的 １．３超微结构观察 细胞膜表面有微绒毛样突起（见图２Ｆ，Ｆ１），多数细 消化收集生长良好的ＥＬＳＣｓ和ＭＳＣｓ，离心使 胞胞浆内有大小不一的空泡（见图２Ｄ），有丰富的粗 其变为细胞团块，加入预冷的２．５ 戊二醛溶液于 面内质网而且明显扩张形成内质网池，池内显示中 ４℃条件下前固定２４ ｈ，吸弃戊二醛，将细胞团块挑 等程度的电子密度（见图２Ｅ，Ｆ，Ｅ１，Ｆ１）。 出，包入擦镜纸内，装入小瓶中，加入ＰＢＳ重复漂洗 ２．３ ＥＬＳＣｓ的核型分析 ３次（每隔。１５ ｍｉｎ １次）。再加入１ 锇酸溶液于室 一直采用无血清培养基在明胶包被过的培养瓶 温条件下后固定１ ｈ。吸弃锇酸，加入ＰＢＳ漂洗，步 中培养、ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ消化连续传代１０代的 骤同上。乙醇逐级脱水，丙酮浸透后，再用环氧树脂 ＥＬＳＣｓ，制备其染色体，观察结果显示：连续传代１０ 包埋，修块，切片后，用柠檬酸铅和醋酸双氧铀复染， 代的ＥＬＳＣｓ核型仍然是正常的（见图３）。 在透射电镜下观察细胞超微结构并拍照。 ３讨论 １．４细胞核型分析 众所周知：无血清培养基（含２Ｏ ＳＲ、２ｒａＭ Ｌ— 消化收集第十代ＥＬＳＣｓ和ＭＳＣｓ，按本实验室 ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ ＮＥＡＡ、０：ｌ ｍＭ ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ 建立的染色体制备方法 进行核型分析，即１ ｍｌ细 和５ ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ的ｋｎｏｃｋｏｕｔ－ＤＭＥＭ培养液）一 中国实验诊断学２Ｏ１２年９月 第１６卷第９期 １６ｌ１一 塞 ｊＩ｝蓉Ｉ１ 薹 ｆ ‘ｌ墨鑫叠毒１１ Ｉｔ Ｉ１ 蒸 Ｉ蠹 纛ｉ蠡 葺 曩 墨 蕃ｌ 暮 臻 ．蒜 纛 叠 ， 图３连续传代ｌ０代的ＥＬＳＣｓ染色体图 在此基础上我们又观察并比较了Ｅｌ ＳＣｓ和 ＭＳＣｓ的超微结构，结果首次发现二者之间存在显 著差别：第四代ＥＬＳＣｓ的一个突出特点是绝大部分 细胞膜表面有十分显著的花朵状的伪足，只有少数 细胞的细胞膜有少量微绒毛样突起，提示Ｅｌ ＳＣｓ形 态比较一致，即纯度较高。细胞膜上大量伪足的出 现可能表明该细胞膜上有某些ＭＳＣｓ细胞膜不具有 的结构，这很可能与Ｂａｔｔｕｌａ报道的一些多潜能抗原 标志的表达有关 ］。Ｅ１ ＳＣｓ的另一个显著特点是胞 浆内有丰富的粗面内质网，但不扩张，表明ＥＬＳＣｓ 处于代谢静息状态。我们知道：粗面内质网是由核 糖体和内质网构成的基本细胞器，是合成分泌性蛋 白、多种膜蛋白和酶蛋白的重要场所，普遍存在于分 泌蛋白质的细胞中，越是分泌旺盛的细胞其数量越 多，如浆细胞，而未分化细胞和肿瘤细胞中较少。与 Ｅｌ ＳＣｓ明显不同的是部分ＭＳＣｓ细胞膜光滑无突 起，部分细胞膜表面有微绒毛样突起，多数细胞胞浆 内有大小不一的空泡，有丰富的粗面内质网而且明 显扩张形成内质网池，池内显示中等程度的电子密 度，表明ＭＳＣｓ形态不一致，即细胞纯度不高，更重 要的是表明ＭＳＣｓ处于细胞活动期，因为扩张的粗 面内质网内有中等程度的电子密度，提示细胞正在 分泌生长或分化所需的物质，即细胞处于一定程度 的分化状态。这些结果证明ＥＬＳＣｓ处于比 ＭＳＣｓ 相对更原始的状态。鉴于ＥＬＳＣｓ和ＭＳＣｓ任超微 结构方面存在的显著差别，我们认为电镜技术可以 成为干细胞鉴定的有效手段，因为即便表型相同（均 表达ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）的ＭＳＣｓ，由于来源不同 其超微结构也明显不同Ｉ】 ，可见电镜技术作为干细 胞鉴别手段其灵敏更高。 已知间充质干细胞连续传代不会导致其核型变 异，为此我们观察了ＥＬＳＣｓ传代的安全性，结果证 实：采用无血清培养基在明胶包被过的培养瓶中培
