乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进_王宁

中国心血管病研究２００７年１２月第５卷第１２期ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＲｅｖｉｅｗ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１２

基础研究

乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进

王宁

李应东

作者单位：甘肃中医学院医疗系（王宁），科研试验中心（李应东）７３００００兰州市，

【摘要】目的对乳鼠的心肌细胞进行原代培养方法的改进。方法参照乳鼠心肌细胞原代培养方

法，并进行改进，选用混合消化酶（０．０８％胰蛋白酶＋０．０４％～０．０６％Ⅱ型胶原酶等量加入的混合液）及ＤＦ培养液进行消化和培养，减少了对心肌细胞的损伤，差速贴壁分离纯化后，加入５－溴－α－脱氧尿嘧啶抑制成纤维细胞增殖。结果法。

本方法培养的心肌细胞存活率为９５．７％，培养２～５ｄ，视野中绝大多数为已搏动的心

本方法是一种较为理想的乳鼠心肌细胞原代培养方

肌细胞和心肌细胞团，成纤维细胞无明显增殖。结论

【关键词】心肌，细胞；细胞培养；乳鼠中图分类号

Ｑ９５－３３；Ｑ２－３３文献标识码Ａ文章编号１６７２－５３０１（２００７）１２－０９２０－０３

Ｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒａｌｍｅｔｈｏｄｏｆｔｈｅｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓ

ＷＡＮＧＮｉｎｇ，ＬＩＹｉｎｇ－ｄｏｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＧａｎｓｕＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ

Ｔｏｉｅｍｐｒｏｖｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｐｒｉｍａｒｙｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ

Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｐｒｉｍａｒｙｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｉｔ，ｃｈｏｏｓｅｔｈｅｍｉｘｔｕｒｅｄｉｇｅｓｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓ（０．０８％ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｎｚｙｍｅａｎｄ０．０４％－０．０６％ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅⅡ）ａｎｄＤＦｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｔｏｄｉｇｅｓｔａｎｄｃｕｌ－ｔｕｒｅｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｉｎｊｕｒｙｔｏｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓ，ａｆｔｅｒｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｄｈｅｓｉｏｎｔｏｓｅｐａｒａｔｅａｎｄｐｕ－ｒｉｆｙｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓ，ａｄｄ５－Ｂｒｄｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ

Ｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｃａｒｄｉａｃ

Ｔｈｉｓ

ｍｙｏｃｙｔｅｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓ９５．７％，ｃｕｌｔｕｒｉｎｇｔｗｏｔｏｆｉｖｅｄａｙｓａｎｄｏｂｓｅｒｖｉｎｇ，ｔｈｅｍａｊｏｒｉｔｙｉｎｖｉｓｕａｌｆｉｅｌｄｓｗｅｒｅｐｕｌｓａｔｉｖｅｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｃｌｕｓｔｅｒ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄｕｎｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄｉｓａｎｉｄｅａｌｏｎｅｔｏｐｒｉｍａｒｙｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ，ｃｅｌｌｓ；Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ；Ｎｅｏｎａｔａｌｒａｔ

心肌细胞原代培养技术已广泛应用于心血管疾病机制及心血管药物的研究。体外培养的心肌细胞能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神经、体液等因素的干扰，因此在心肌细胞的生长、发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要意义。自１９６０年Ｈａｒａｒａｃｙ等首次对乳鼠的心肌细胞进行培养以来［１］，国内外许多学者对心肌细胞原代培养方法进行了研究。我们在总结文献［２－６］报道方法的基础上，经过多次实验摸索，建立了简单、稳定、可靠的乳鼠心肌细胞培养方法。１材料与方法

１．１实验动物Ｗｉｓｔａｒ乳鼠，１～３ｄ龄，雌雄不限，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供。

（低糖）１．２主要试剂及实验设备ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ，美国）、（Ｇｉｂｃｏ，美国）、ＨａｍＦ１２培养基５－溴

脱氧尿嘧啶（Ｓｉｇｍａ，美国）均购自上海鹏程生物技术有限公司；胰蛋白酶（Ａｍｒｅｓｃｏ，美国）、Ⅱ型胶原酶

（Ｓｉｇｍａ，美国）购自上海鹏程生物技术有限公司；新生牛血清（ＮＢＣＳ，杭州四季青）购自上海生物公程技术有限公司。α－横纹肌肌动蛋白单克隆抗体（α－

，链霉素亲和素－生物素－过ｓａｒｃｏｍｅｒｉ－ｃａｃｔｉｎ，α－ＳＡ）

氧化物酶复合物（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｂｉｏｔｉｎｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ免疫组化试剂盒购自武汉博士德生ｃｏｍｐｌｅｘ，ＳＡＢＣ）

物工程有限公司。其他试剂均为分析纯。二氧化碳培养箱（德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司）；超净工作台（苏净集团）；倒置相差光学显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）。１．３试剂配制

溶１．３．１消化液的配制将胰蛋白酶（无菌分装）

于ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ７．２～中，配成０．０８％的胰蛋７．４）白酶消化液；将Ⅱ型胶原酶（无菌分装）溶于已配制

中国心血管病研究２００７年１２月第５卷第１２期ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＲｅｖｉｅｗ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１２

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好的胰蛋白酶消化液中，配成０．０４％～０．０６％的混合

酶消化液。

１．３．２培养液的配制将ＤＭＥＭ培养基与ＨａｍＦ

在培养液中加入１５％１２培养基按１∶１比例混合后，

碳酸氢钠调节ｐＨ为７．２～７．４。ＮＢＣＳ和１％双抗，

１．４细胞分离培养乳鼠心肌细胞的原代培养及

纯化，根据Ｓｉｍｐｏｎ的方法［２］。取１～３ｄ龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠，用７５％的酒精棉球将其全身擦洗消毒，然后乙醚麻醉，暴露心脏，于７５％酒精再消毒。无菌开胸，心脏收缩期剪下心脏，置于预冷的盛ＰＢＳ缓冲液的培养皿中，清洗３次，以去除血污，取心尖部组织剪为１～３ｍｍ３碎块，加入０．０８％胰蛋白酶溶液消化

待自然沉淀后弃上清。剩余组织块中加入１０ｍｉｎ，

混合消化酶（０．０８％胰蛋白酶＋０．０４％～０．０６％Ⅱ型

胶原酶等量加入的混合液）置３７℃水浴消化７～８ｍｉｎ，静置后将上清液移入盛有１５％新生牛血清的ＤＦ培养液的离心管中终止消化，并以１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ（离心半径为６ｃｍ），弃上清液，用ＤＦ培养液充分吹打成单细胞悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化变为半透明状为止。收集各次消化所得细胞悬液接种于

采取差速贴壁法和化学方法分离１００ｍｌ培养瓶中。

纯化心肌细胞。３７℃、５％ＣＯ２培养箱中孵育１．５～

分离纯化心肌细胞。非心肌细胞贴壁速度较２．０ｈ，快，首先附在瓶底，心肌细胞仍处于悬浮状态。吸出细胞悬液离心，将沉淀混悬按０．８×１０个／ｍ２的密度接种于５０ｍｌ培养瓶，其中置一０．５ｃｍ×１ｃｍ的盖玻片（预先用鼠尾胶原处理），以便做免疫组化进行纯度鉴定。用０．１ｍｍｏｌ／Ｌ５－Ｂｒｄｕ的培养基培养３以抑制非心肌细胞增殖，然后换为常规培养基培ｄ，养，每２～３ｄ换液１次。１．５存活率检测取细胞悬液，用适量０．４％锥虫蓝稀释，混匀后滴于血细胞计数板上，倒置相差光学显微镜下观察细胞形态并计总数，着色者为死细胞，不着色者为活细胞。计算细胞存活率。１．６细胞鉴定采用α－横纹肌肌动蛋白单克隆抗体行免疫细胞化学染色，用流式细胞仪行培养细胞鉴定。

在培１．７纯度检测用α－ＳＡ标记心肌肌动蛋白。

养心肌细胞中α位－ＳＡ抗原表达阳性，呈棕黄色，于胞质；非心肌细胞中阴性，因此，培养心肌细胞－ＳＡ阳性率反映心肌细胞数量，可作为心肌细胞α

纯度鉴定的指标。镜下任选１０个视野，计数２００个细胞视野，计算阳性细胞的比率。

２结果

２．１细胞形态观察倒置相差光学显微镜下观察，刚分离的心肌细胞呈球形，培养４ｈ细胞开始贴壁生长，呈圆形或椭圆形，后变为梭形，细胞在瓶壁逐渐展开、伸出伪足，变为三角形、多边形等形态，核仁清晰；培养１２ｈ细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，搏动的频率、节律不同；培养２４ｈ后可完全贴壁；培养３～４ｄ后可形成单层，第３天细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，收缩明显而有力，形成所谓功能性合体细胞，搏动频率多在４０～同一１１０次／ｍｉｎ。培养瓶中细胞簇间的搏动频率可不同。培养的心肌细胞在３～１８ｄ无论细胞形态还是细胞活力都良好，在此期间可加各种处理因素进行实验研究，第搏动次数减少，其１９天时心肌细胞活力开始下降，

搏动由周缘向心搏动变为从两端向中心方向收缩，颇似肌纤维束的收缩，心肌细胞形态开始发生改变，细胞簇周围有部分脱落，使细胞单层由椭圆形变成梭形，第２１天时部分细胞停止搏动，形态发生很大变化，心肌细胞的胞质出现空泡和粗大颗粒样物质，细胞皱缩、脱落。在相差显微镜下，从细胞的搏动性及形态，可分为两类细胞：心肌细胞搏动，胞质颜色较深，有颗粒样物质，略显粗糙，细胞核小，椭圆形，颜色较深，通常为１个核；成纤维细胞不搏动，平坦，胞质透明，显得很薄，细胞核小，椭圆形，颜色淡，经常含有２～３个核。

其中３１个着色２．２存活率共计数７２１个细胞，

阳性，细胞存活率为９５．７％。心肌细胞培养２４ｈ后，观察液面无悬浮的死细胞。２．３纯度培养２～５ｄ观察，视野中绝大多数为已搏动的心肌细胞和心肌细胞团，成纤维细胞无明显增殖。

３讨论

心肌细胞在分离过程中易受损伤，活细胞也很少，不易传代，因此培养时细胞产量低，实验效率不高。减轻分离过程中的损伤是心肌细胞培养成功的关键。心肌细胞培养易受培养技术及处理条件影响，对消化酶的处理极其敏感，消化过度或酶使用不当均能导致心肌细胞丧失贴壁和（或）自发节律性搏动的能力。心肌细胞培养的另一个普遍问题是成纤维细胞的污染。成纤维细胞培养１～１．５ｈ后基本贴壁完全，而心肌细胞贴壁较慢，利用这一特

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中国心血管病研究２００７年１２月第５卷第１２期ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＲｅｖｉｅｗ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１２

点，可用差速贴壁法把两种细胞分离。尽管差速贴壁分离法能纯化心肌细胞至９０％～但９５％纯度［５］，增殖迅速的成纤维细胞能很快从数量上压倒心肌细胞，培养４～５ｄ后成纤维细胞即可增殖到与心肌细胞比例为２∶３以上。因此如何使心肌细胞培养的方法更为简单，并且使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度，是体外培养心肌细胞模型的关键问题。我们在操作过程中注意了以下几点：①选择消化作用较温和且适于消化分离心肌细胞的Ⅱ型胶原酶加入到消化作用较强的胰蛋白酶中以缓冲胰蛋白酶对心肌细胞的损伤，Ⅱ型胶原酶的浓度选择在０．０４％～又０．０６％为宜，既可较快地消化组织块，不会对心肌细胞造成损伤。②消化时水浴温度应恒定，以３７℃为宜，首次消化选择０．０８％胰蛋白酶溶液消化心肌细胞１０ｍｉｎ，以后选择混合消化酶（０．０８％胰蛋白酶＋０．０４％～０．０６％Ⅱ型胶原酶等量加入的混合液）消化７～８ｍｉｎ，直至将组织基本完全消化变为半透明状为止。消化时间过长、温度过高均会使心肌细胞丧失活性。选用ＤＦ培养液，ｐＨ调整在７．２～７．４范围内，偏高或偏低均会影响心肌细胞的正常生长，并减弱或丧失自发性搏动的能力。③离心时间过长或离心力过大均会造成心肌细胞的机械性损伤，选用１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ为宜。

加入５－溴－α④经差速贴壁分离法纯化后，－脱氧尿

嘧啶抑制成纤维细胞的ＤＮＡ和蛋白合成，通过抑制成纤维细胞的增殖，保证培养３～５ｄ后心肌细胞仍可保持较高纯度。

体外细胞培养技术在药学研究领域的应用表现在药理方面，近年来在靶向制剂的体外靶向性评价及其机制研究中的优势受到广泛重视［７－９］。本研究介绍的心肌细胞原代培养方法，细胞贴壁快、搏动早、纯度高，而且操作简便，重复性好，是一种较

为理想的心肌细胞原代培养方法。用此法制作的心

肌细胞培养模型，可以满足各种生理及药理实验的要求。

４参考文献

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（收稿日期：２００７－０８－３１）

消息

波士顿公司第三代药物洗脱支架开始临床试验

—ＴＡＸＵＳ２００７年７月１９日，波士顿公司宣布开始ＴＡＸＵＳＰＥＲＳＥＵＳ试验，旨在评价其生产的第三代紫杉醇洗脱支架——该临床试验将注册１００个在美国和其他国际医疗中心的１５００例患者。Ｅｌｅｍｅｎｔ。ＴＡＸＵＳＥｌｅｍｅｎｔ支架采用专利技术生产的铂铬合金，配以新型支架设计，从而使支架壁的支柱更加细小，增加了灵活性，改善了弹性回缩和Ｘ光透过性。此外，ＴＡＸＵＳＥｌｅｍｅｎｔ支架平台还采用了新型的球囊技术。该临床试验将分为两个研究分别进行。目前还不能上市。ＴＡＸＵＳＥｌｅｍｅｎｔ还处在研发阶段，

（阙斌摘自ＴＣＴＭＤ）