液相色谱法测定草鱼中喹乙醇残留量的不确定度分析

液相色谱法测定草鱼中喹乙醇残留量的不确定度分析

摘 要：本文依据jjg1059-1999《测量不确定度评定与结果表示》，采用分层建模的方法，对液相色谱法测定喹乙醇的不确定度来源进行了逐层的分析和合成，得出了用液相色谱法测定草鱼中喹乙醇的不确定度结果。

关键词：液相色谱；不确定度；喹乙醇 中图分类号：r155 文献标识码：a

测量不确定度是对测量结果可信性、有效性的怀疑程度或不肯定程度，是判定测量结果准确度的依据。二十世纪七十年代，国际上已有很多计量学者开始用“不确定度”代替“误差”，开启了不确定度在测量领域的应用篇章。目前，各国均有评定不确定度的相关规范，测量不确定度评定已经成为检测和校准实验室必不可少的工作之一。

喹乙醇是一种化学合成的喹噁啉类广谱抗菌药物，具有蛋白同化作用，可提高饲料转化率与瘦肉率，促进动物生长，又被称为“水产瘦肉精”。然而由于喹乙醇具有中度至明显的蓄积毒性、致畸作用和一定的遗传毒性，对人也有潜在致畸性，致突变性和致癌性。因此农业部在2001年第168号公告中严格禁止在水产养殖中使用喹乙醇。尽管如此喹乙醇滥用现象仍然存在，并且发生了因滥用喹乙醇的大面积死鱼事件，引发社会广泛关注。因此，需要加强对喹乙醇药物残留的检测工作，进一步提高其检测方法的准确度。本文

依据标准“jjf1059- 1999《测量不确定度评定与表示》[1]”中的评定方法，分析了采用液相法测定草鱼中喹乙醇含量的不确定度，以期得到更加科学、准确的检测结果。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器

草鱼 购于某市3家农贸市场和5家超市；喹乙醇标准品 购于中国计量科学研究院，标准值99.1%；乙腈 色谱纯；正己烷 色谱纯；甲醇 色谱纯；无水硫酸钠 分析纯。

agilent1100液相色谱仪 配紫外检测器；色谱柱 ods-c18柱（5um， 250mm ×4.6mm）；25ul微量进样器 1.2 实验方法 1.2.1 标准溶液配制

准确称取喹乙醇标准品10mg，用少量水溶解，用甲醇稀释至100ml，得到浓度为10ug/ml的标准贮备液，再依次稀释为5ug/ml、2 ug/ml、1ug/ml、0.5 ug/ml和0.1ug/ml的标准工作液。 1.2.2 测定过程

采用sc/t3019-2004方法[2]。过程如下：称10g鱼糜（添加2ug/ml标样1ml），加入1g助滤剂，乙腈30ml，均质1min，以4000r/min离心10min，将上清液倒入150ml锥形瓶中，再向残留物中加入20ml乙腈，同上均质，离心，合并上清液。向乙腈提取液中加入正己烷10ml，振荡5min，静置分层。弃去正己烷相，再

加入正己烷10ml，振荡5min，静置分层，将乙腈层转移到茄形瓶中，在45℃水浴中旋转蒸发除去溶剂，用1ml15%甲醇水溶液溶解残留物，经0.45um微孔滤膜过滤后，上机测定。 1.2.3 液相色谱条件

流动相：15%甲醇水溶液；流速：1.0ml/min；柱温： 35℃；检测器波长：380nm；进样量：20ul 2 数学模型与不确定度的来源 2.1 数学模型

喹乙醇含量的计算公式为：x=

式中：x为样品中待测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c为待测组分的浓度，单位为微克每毫升（ug/ml）；v为样液最终定容体积，单位为毫升（ml）；m为样品质量，单位为克（g）。 2.2 不确定度的分类及来源

根据不确定度的评定方式可将其分为a类和b类两种，两种不确定度均为标准不确定度，其中a类不确定度是采用对观测列进行统计分析的方法来进行评定，例如标准曲线拟合及试验的回收率两方面所产生的不确定度即均属a类不确定度。b类不确定度是用非统计方法进行评定的，例如天平、实验容器等产生的不确定度均属于b类不确定度。采用液相法测量草鱼中喹乙醇的过程中所产生的不确定度，即可按以上两个分类方法进行归纳，包括以下几个方面： 2.2.1 a类不确定度：

包括标准曲线拟合的不确定度、样品处理操作过程差异的不确定度

2.2.2 b类不确定度：

根据喹乙醇测量的具体过程，b类不确定度主要来源于标准物质、标准溶液配制、样品称量、定容及液相色谱峰面积几个方面，其中标准物质引入的不确定度包括其自身纯度及称量过程两方面，标准溶液配制时引入的不确定度则来源于使用器皿温度的变化及器皿校准两方面。 3 不确定度的评定 3.1 a类不确定度的评定 3.1.1 标准曲线拟合的不确定度

分别对5个浓度梯度的喹乙醇标准溶液进行测定，每个浓度梯度重复测定5次，其测定结果见表1 表1 标准溶液重复5次测量结果 浓度

/（ug/ml） 峰面积 1 2 3 4 5 平均值

0.1 3.4 3.5 3.47 3.52 3.5 3.48 0.5 17.1 17 16.8 17.3 17.5 17.14 1.0 35 36.2 35.5 36 35.8 35.7 2.0 72.1 71.8 72 71 71.5 71.7

5.0 186.2 185.6 184.8 185.0 186 185.5

根据表1的结果，利用spss统计软件进行最小二乘法拟合，得到标准曲线为y=37.255x-1.375，r2=1.0，其中x表示浓度，y表示峰面积，r表示相关系数。

对添加标样的样品重复5次测量的结果见表2。 表2 样品添加5次重复测量结果 标样添 加浓度

/（mg/kg） 测定的含量/（mg/kg） 1 2 3 4 5 平均值

0.2 0.181 0.196 0.205 0.201 0.1 0.194 不确定度的计算公式为：

式中：u（curve）为用标准曲线求c0时产生的不确定度；s为拟合曲线的标准偏差；p为测定次数，p=5；c0为样品溶液中喹乙醇的浓度，ug/kg； 为标准溶液中喹乙醇浓度的测定平均值，ug/kg，=3.07ug/kg，i为校准溶液的数量，i=5。aij为标准溶液峰面积；a为拟合标准曲线斜率；b为拟合标准曲线截距； cij为标准曲线浓度；i为标准溶液的数量，i=5；j为获得校准曲线的测量次数，j=5；m为标准系列的点数，m=5；n为每个点平行测定的次数，n=5。 则求得s=0.06。故u（curve）=0.012，则标准曲线拟合产生的相

对不确定度urel（curve） ==0.016/0.194=0.061 3.1.2样品处理的不确定度

用液相色谱法测定喹乙醇残留量的试验过程中，样品本身的均匀性、操作人员的一致性和仪器的性能等均可对检测的结果一致性产生影响，即产生不确定度。为探寻这部分不确定度的大小，本文用回收率试验进行评定，在0.1～10mg/kg范围内，分别添加5个浓度的标准溶液进行回收率试验，结果回收率在

102.5%～90.5%，产生的标准不确定度urel（rec）=，式中xmax为最高回收率，xmin为最低回收率，n为测定次数，可以得出样品处理操作过程差异的不确定度urel（rec）=0.0。 3.2 b类不确定度的评定 3.2.1 标准物质的不确定度

喹乙醇标准物质来源于国家标准物质中心，标准物质证书中标明其扩展不确定度u=1%，包含因子k=2，则其标准不确定度u（std） = u/k =1%/2= 0.005，标准物质证书中给出喹乙醇含量为98.2%，则其相对标准不确定度为u1rel = u（std） / 99.1% = 0.005 / 98.2%= 0.005

3.2.2 标准物质称量产生的不确定度

配制喹乙醇标准溶液时称样量为0.01g，天平检定证书中质量允许误差为δ=±0.5mg，满足正态分布，包含因子k=3，所以其标准不确定度u2=，其相对标准不确定度为u2rel= = =0.0167。

3.2.3器皿产生的不确定度

依据标准jjg196-2006《常用玻璃量具检定规程》的要求[3]，标准溶液配制所用的玻璃量具均有最大允许差，属矩形分布，，其相对不确定度如表3。

表3 各玻璃量具校准产生的不确定度 玻璃量器 最大允许差/ml 相对标准不确定度 100ml容量瓶a级 ±0.10 u1=5.77×10-4 2ml移液管a级 ±0.012 u2=3.45×10-3 10ml容量瓶a级 ±0.02 u3=3.46×10-3 5ml移液管a级 ±0.015 u4=3.0×10-4 由表3引起的总不确定度为： u3rel= = =0.0008

3.2.4 标准溶液配置过程中温度变化产生的不确定度 实验室的温度变化对玻璃容器影响较小，可忽略不计，但对溶剂的影响则需归入不确定度评定范围，实验室温度变化范围一般为20±8℃，在此温度范围内相应的水的膨胀系数2.1×10-4℃-1，满足矩形分布。

表4玻璃容器的不确定度

玻璃量器 标准不确定度 相对标准不确定度

100ml容量瓶a级 0.0606 u1=6.1×10-4 2ml移液管a级 0.00121 u2=6.1×10-4 10ml容量瓶a级 0.00606 u3=6.1×10-4 5ml移液管a级 0.00303 u4=6.1×10-4 环境温度变化引起的总不确定度为： u4rel===0.0012

因此标准溶液配制中，标准物质本身、称量过程、玻璃容器及温度等所产生的不确定度，可合成为 3.2.5 称量的不确定度

根据喹乙醇检测标准，称样量为10.002g，称量使用天平的最小分度为1mg，经检定合格，其最大允许误差为±5mg，满足正态分布，包含因子k=3，由此引入的标准不确定度为 u（m）==1.67×10-3，则其相对标准不确定度为 urel（m）==0.000167

3.2.6 试样定容体积的不确定度

依据标准jjg-196-2006《常用玻璃量具检定规程》，样品定容所使用移液管的最大允许误差为±0.008ml，属矩形

分布，产生的标准不确定度为u（v）=，其相对标准不确定度urel（v）=

3.2.7 液相色谱峰面积引起的不确定度

样品峰面积的重复性已包含于回收率的不确定度中，峰面积的

偏倚由仪器的校准引人。检定证书给出了仪器的最大允差为±2%，k=3，则相对标准不确定度为urel（a）=2%/3=0.006。 3.3 合成标准不确定度

综上，采用标准“sc/t3019-2004水产品中喹乙醇残留量的测定液相色谱法”测定草鱼中喹乙醇含量的合成标准不确定度为： urel（y）=0.2× 3.4 扩展不确定度

依据我国不确定度评定规范，本文中扩展不确定度的包含因子取k=2，则液相法测喹乙醇残留量的扩展不确定度为u=k×urel（y）=2×0.017=0.034 3.5 测量不确定度报告

草鱼中喹乙醇含量的测量结果为y=0.2mg/kg±0.034mg/kg，k=2。 4 结论

本文分别从标准物质、标准曲线拟合、样品称量、处理及定容、色谱峰面积等方面对采用标准“sc/t3019-2004”测定草鱼中喹乙醇含量的不确定度进行了评定，评定结果显示诸多影响测量结果不确定度因素中样品处理过程影响最大，因此应尽量提高样品处理操作过程的平行性，以保证测量草鱼中喹乙醇含量的准确性。 参考文献

[1] jjf1059-1999测量部确定度评定与表示[s].国家质量技术

监督局发布.

[2] 国家质量监督检验检疫总局sc/t3019-2004水产品中喹乙醇残留量的测定 液相色谱法[s].北京：中国标准出版社. [3]jjg196-2006常用玻璃量具检定规程[s].北京.中国计量出版社.

作者简介：刘学光（1973-），辽宁省水产品质量安全检验检测局，高级工程师，研究方向：水产品养殖与质量安全检验检测。