酶解猪皮胶原蛋白制备抗氧化产物的研究

酶解猪皮胶原蛋白制备抗氧　陈　霞，赵金杨，刘　毅，周　婷，　（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京　摘要：以猪皮为原料，首先对猪皮胶原蛋白进行高温变性处理，再通过胃蛋白酶降解，用硫代　巴比妥酸法（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ａｓｓａｙ，ＴＢＡ法）评价酶解产物的抗氧化活性，并　用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳测定产物的分子量。结果表明，高温处理猪皮５　ｍｉｎ，胃蛋白酶用量为底物的　１．５％，酶解时间为０．５　ｈ，酶解产物的抗氧化活性最强。但与抗坏血酸相比，酶解产物没有表现出　还原能力。　关键词：胶原蛋白；酶解；抗氧化　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆＥｎｚｙｍｅ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｉｎ　Ｐｉｇ　Ｓｋｉｎ　ｔｏ　Ｐｒｅｐａｒｅ　Ａｎｔｉｏｘｉｄａｆｉｖｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ＣＨＥＮ　Ｘｉａ，ＺＨＡＯ　Ｊｉｎ－ｙａｎｇ，ＬＩＵ　Ｙｉ，ＺＨＯＵ　Ｔｉｎｇ，ＤＡＩ　Ｒｕｉ－ｔｏｎｇ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｎｕｔｉｒｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｉｇ　ｓｋｉｎ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｉｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｗｉｔｈ　ｐｅｐｓｉｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｄｅｎａｔｕｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ｉｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ａｓｓａｙ（ＴＢＡ）．Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ｉｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ．Ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｈｙｄｒｏｌｙ－　ｓｉｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｉｓ　ｇｉｖｅｎ　ａｓ　ｄｅｎａｔｕｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　５　ｒａｉｎ，ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｐｅｐｓｉｎ　１．５％，ｔｏｔａｌ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｔｉｍｅ　ｉｓ　０．５　ｈ．　Ｋ吖ｗｏｒｄｓ：ｃｏｌｌａｇｅｎ；ｅｎｚｙｍｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　中图分类号：ＴＳ２０２－３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９—６２２１（２００７）０３—００２８—０４　目前，降解胶原蛋白的方法有酸法、碱法、酶　法以及酶法与其他方法的结合。酸水解和碱水解　ｌ　材料和方法　迅速彻底，但都会造成氨基酸损失；酶法降解条件　温和且易控制，氨基酸不被破坏，产物分子量分布　１．１材料与仪器　具有特点，有利于研发成高附加值产品。　鲜猪皮购于北京超市；无水乙醇、冰醋酸、亚　笔者以鲜猪皮为原料，首先通过高温破坏猪皮　油酸、三氯乙酸（ＴＣＡ）（均为分析纯）；硫代巴比妥　ＴＢＡ）生化试剂；胃蛋白酶Ａｍｒｅｓｃｏ进口分装；　天然胶原的稳定结构，再用胃蛋白酶进行酶解得　酸（到降解产物，并利用硫代巴比妥酸法（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉ—　蛋白标准品购于上海。　ｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ　ａｓｓａｙ，ＴＢＡ法）评价降　解产物的抗氧化性。　ＧＬ一２０Ｇ—ＩＩ高速冷冻离心机由上海安亭科学　仪器厂生产；ＵＶ一２　１０２Ｃ型紫外可见分光光度计由　尤尼柯（上海）仪器有限公司提供；ＬＧＪ一１２冷冻干　燥机由北京松源华兴科技发展有限公司提供；台式　酸度计ｐＨ２１ｌ由哈纳（ＨＡＮＮＡ）公司提供；聚丙烯　酰胺凝胶电泳装置由美国伯乐Ｂｉｏ—ｒａｄ公司提供。　维普资讯 http://www.cqvip.com

１．２试验方法　３　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ。取上清液２．５　ｍＬ，加入　５　ｍＬ蒸馏水和０．５　ｍＬ　０．１％（ｗ／ｖ）的三氯化铁溶　新鲜猪皮剔除皮下组织和脂肪，切　２．１．２．１前处理　混匀在７００　ｎｍ处测定吸光值。吸光值越大，　成０．５　ｃｍｘ３　ｃｍ规格猪皮条。定量称取猪皮条（试　液，验者可根据需要决定具体重量），用４０℃热水清洗　则样品的还原能力越强。以水代替样品作为空白　两次，然后在４０℃水浴中用３倍（ｇ／ｇ）５％一１０％　较零，并以抗坏血酸代替样品作为对照。　Ｎａ　ＣＯ　溶液处理１５　ｍｉｎ，除去杂蛋白与脂肪，再用　１．５％的ＨＣ１中和。取出猪皮，加入２倍（ｇ，ｇ）的水中，　２　结果与讨论　分别在１２１℃高温下处理５　ｍｉｎ、１５　ｍｉｎ、２５　ｍｉｎ，主　１猪皮胶原蛋白酶解条件的确定　要考察高温处理的时间对酶解产物抗氧化性的影　２．响。然后将处理后的猪皮条与汤混合打碎。　１．２．２酶　解２．１．１高温处理时间对酶解产物抗氧化性的影响虽　参照文献［４】的方法略加修改。称取　然对胶原的研究已经有超过９０年的历史，但由于　绞碎的猪皮（６．００＿＋０．０２）ｇ置具塞三角瓶中，加入　０．５　ｍｏｌ／Ｌ醋酸溶液１００ｍＬ，加入胃蛋白酶，在３９℃　水浴中水解。水解结束后，用３０％ＮａＯＨ溶液调节ｐＨ　值大于１２灭酶。然后用盐酸调节到中Ｉ生，在１２０００　ｒｐｍ、４℃条件下离心３０　ｍｉｎ。上清液冷冻干燥。考察　胃蛋白酶用量及水解时间对产物抗氧化性的影响。　１．２－３硫代巴比妥酸法（ＴＢＡ法）测定抗氧化性１５，６１　称取冷冻干燥后的粉末配成样品溶液。在具塞试管　中加入０．１　Ｍ的磷酸缓冲液（ｐＨ　７．０）３　ｍＬ，５０　ｍＭ的　亚油酸无水乙醇溶液２　ｍＬ，及样品溶液１　ｍＬ；混合　均匀后于６０℃避光放置７２　ｈ。然后从具塞试管中取　出样品１．０　ｍＬ，加入２．０　ｍＬ　２０％（ｗ／ｖ）的三氯乙酸　（ＴＣＡ）溶液和２．０　ｍＬ　０．６７％（ｗ／ｖ）的硫代巴比妥酸　（ＴＢＡ）溶液，沸水浴１５　ｍｉｎ，流水冷却后３　０００　ｒ／　ｍｉｎ离心２０　ｍｉｎ，取上清液在５３２　ｎｍ下测定吸光值；　以蒸馏水代替样品作为对照（ｃｋ），按照下列公式　计算过氧化抑制率：　过氧化抑制率（％）＝（１一样品管吸光值／对照　管吸光值）ｘ１００％　１．２．４胶原蛋白酶解产物氨基酸组成的分析　由中　国农业科学院畜牧研究所分析中心测定。　１．２．５分子量测定【７ｌ用ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳　法测定猪皮胶原蛋白酶解产物的分子量，以期得　到样品分子量分布规律，建立酶解条件和分子量分　布之间的关系。　试验条件：　ｓ一甘氨酸电极缓冲液体系，考马　斯亮蓝染色，乙醇一冰醋酸溶液脱色，分离胶浓度　为１２．５％，浓缩胶浓度为４．５％，样品浓度为２０　ｍｇ／　ｍＬ，上样量为２０　Ｌ。　１．２．６还原能力测定１６，８１取２．０ｍＬ不同浓度的样品　（０．５～２０　ｍｇ／ｍＬ）￣ＪＩＪｋ，２．０　ｍＬ　ｐＨ　６．６的磷酸缓冲液　（０．２　ｍ０觇）和２．０　ｍＬ　１％（ｗ／ｖ）的铁溶液，混　合均匀后在５０℃条件下放置２０　ｍｉｎ，然后迅速冷却，　加入２．０　ｍＬ　１０％（ｗ／ｖ）的三氯乙酸溶液，混匀后以　胶原有十分稳定的结构并且不溶于水，要想将它们　由组织中分离出来并纯化非常困难。所以笔者直接　以胶原蛋白含量很高的猪皮为原料，并且在酶解之　前对猪皮进行１２１ｏＣ高温处理，破坏胶原蛋白的稳　定结构，令其螺旋松散，使得大部分酶作用位点暴　露出来，以利于蛋白酶的结合。在试验中，固定酶解　的时间为１０　ｈ，胃蛋白酶用量为底物的１％，高温处　理时间分别为５　ｍｉｎ、１５　ｍｉｎ和２５　ｍｉｎ，并用ＴＢＡ　法考察不同的高温处理时间对酶解产物抗氧化性　的影响。从图１中可以看出，高温对酶解产物的抗　氧化性影响比较显著，而高温处理５　门Ｕｍｉｎ后再进行　　酶解，得到的产物抗氧化活性最大。　１００．０　８０　０　６０．０　犯　嚣４０・０　２０．０　０．０　５　ｌ５　２５　高温处理时问／ｍｉｎ　图１高温处理时间对酶解产物抗氧化性的影响　２．１．２酶用量对酶解产物抗氧化性的影响　在高温　处理５　ｍｉｎ，酶解的时间为１０　ｈ的条件下讨论酶用　量对产物抗氧化性的影响。从图２可以看出，酶用　１００．００　８０．００　堡６０．００　褂　鉴４０．００　２０．００　０．００　０．１　０．５　１　１．５　２　酶占底物的质量百分数，％　图２酶用■对酶解产物抗氧化性的影响　维普资讯 http://www.cqvip.com

加一Ｈｌ一一一一工【｛墨　　５％时，得到的产物抗氧化活性最高。的１．　２．１．３酶解时间对产物抗氧化性的影响　在高温处　理５　ｍｉｎ，酶用量为底物的１．５％条件下进行试验，　对不同酶解时间的产物抗氧化活性作一比较。从　图３可以看出，酶解时间为０．５　ｈ时，抗氧化活性　二二　量是影响抗氧化性的因素之一。当酶用量是底物　∞∞０　ｏ　０Ｊ　■一百　０　０　ＤＪ　ｏ　ｌｓ　表１　酶解产物氨基酸组成　显■■　黯一　最好，随着酶解时间的延长抗氧化活性逐渐降低。　在酶解２～８　ｈ时得到的产物抗氧化性基本不变。但　当酶解１０ｈ时，活性又有所提高，之后又下降。总　体的变化趋势并不是单一的。根据资料分析，蛋白　质多肽的抗氧化机理主要有以下几个方面：（１）蛋　白质多肽与油脂具有很好的亲和力，多肽将油脂　包裹起来起乳化作用，可以有效地抑制油脂与活　性氧的结合ｌ４１。所以，在有效范围内，多肽的相对　分子质量越大，抗氧化的效果越好。（２）蛋白质及　多肽可以有效地螯合金属离子，阻止金属离子与　自由基的结合，使金属离子不能被氧化ｌ４１。（３）蛋　白质多肽的残基，如一ＮＨ　、一ＳＨ等以及某些氨基　酸，如脯氨酸、组氨酸等，能与脂质氧化的不稳定　产物、自由基等发生反应，或者能够捕捉活性氧，　中止自由基连锁反应，即有一定的抗氧化作用［９１。　在这种情况下，多肽的分子较小，可以使上述一些　氨基酸或者残基暴露出来，则抗氧化性增加。　通过上述试验，可以确定猪皮胶原蛋白酶解的　最适条件是：高温处理猪皮５　ｍｉｎ后，称取绞碎的　猪皮６．００　ｇ于１００　ｍＬ　０．５　ｍｏｌ／Ｌ醋酸溶液中，胃蛋　白酶用量为底物的１．５％，酶解的时间为０．５　ｈ。　１ＯＯ．ＯＯ　８Ｏ．ＯＯ　６０．００　嵇卜　妻４ｏ．００　－￣ｇ　２Ｏ．ＯＯ　０．００　０．５　１　２　４　§８　１０　１２　酶解时间，ｌｌ　图３不同酶解时间的产物抗氧化性比较　２．２酶解产物的氨基酸组成分析　氨基酸分析仪测得的酶解产物氨基酸组成参　见表１。从表１中还可以看出，甘氨酸的含量最为　丰富，几乎占总蛋白量的１，３，符合胶原蛋白的氨基　酸含量特征。脯氨酸的含量也很高。但由于氨基酸　分析仪不能测出羟脯氨酸，所以在表１中没有表示　注：　氨基酸占样品中蛋白质的百分比。　出其含量。该酶解产物的必需氨基酸含量丰富，具　有较高的营养价值，同时谷氨酸、甘氨酸等呈味氨　基酸含量高可以提高风味，增加应用价值。　２．３酶解产物分子量的测定　按上述最适条件制备样品，用ＳＤＳ一聚丙烯酰　胺凝胶电泳法测定样品的分子量分布规律，结果参　见图４。从图４中可以看出，产物复杂，电泳条带多；　分子量在３０　ＫＤ左右的条带比较清晰，而凝胶上　部、分子量较大的条带则呈连续分布。因为胃蛋白　酶作用的时间比较短，胶原蛋白降解不完全，所得　样品的分子量比较大，主要集中在凝胶的中上部。　２．４酶解产物还原能力的测定　还原能力是物质抗氧化活性的重要体现。还　原能力的测定以样品是否为一良好电子供体为　指标。还原力大的样品是良好的电子供应者，其　供应的电子可以使Ｆｅ　还原为Ｆｅ　＋¨０１。从图５可　以看出，当对照抗坏血酸的浓度为０．５　ｍｇ／ｍＬ时，　溶液的吸光值就已经很高，表明抗坏血酸具有很　强的还原能力，并且在一定范围内还原力随ＶＣ　浓度增加而增强。而酶解产物没有表现出还原能　力。这说明它不能作为电子供体使Ｆｅ　还原为　Ｆｅｈ。所以，如２．１．３所述，酶解产物表现出抗氧化　性主要由于前两个因素具有良好的乳化作用与　螯合作用。　维普资讯 http://www.cqvip.com

固蛰致瀚骥黎　～说明使用。（９）保鲜剂处理后，库温最好保　持在ｌ３～ｌ５℃，库内相对湿度控制在７０％　７５％。（１Ｏ）为了防止贮藏库过度潮湿，要　（１）产品在人贮前要对贮藏库彻底消毒灭菌，　在地面撒一层石灰粉。与库外应经常通风换气。贮　消毒剂以ＣＴ一高效库房消毒剂为佳，每１００　ｍ　使　藏初期只要库外温度不超过ｌ５℃，就要连续不断　用５００　ｇ，按说明使用。（２）产品入库前把库温降至　地通风，若外界气温高，每天在清晨和傍晚与外界　ｌ３℃。（３）选择适宜的品种，绿皮冬瓜比灰皮冬瓜　通风。当库温低于ｌ０℃时，要人工加热，库温最好　耐贮藏。（４）达到充分成熟的冬瓜耐贮，而嫩冬瓜不　保持在ｌ３～ｌ５℃。在不需制冷的寒冷季节，也要保　耐贮藏。（５）天津地区９月中下旬采收的绿皮、成熟　证每天有５次的冷藏库内部空气循环，每次半小　的大冬瓜一般可贮３～５个月。（６）采收时要留一　时，以便循环和降湿，防止微生物侵染造成腐烂。　小段瓜秧，注意防止瓜与瓜碰撞产生机械伤害，造　（１１）贮藏２个月后，要进行第二次保鲜剂（果蔬烟　成微生物侵染，最好每瓜包一张报纸散装装车，注　熏剂）处理，每１００　ｍ　使用５００　ｇ，按说明使用。这　意采收前一周不准灌水，禁止雨天采收冬瓜，入库　样可大大增强防腐保鲜效果。　之前严防雨淋。（７）贮藏最好使用架藏，瓜不超过　３层。（８）人贮２４　ｈ以后，等瓜温降到ｌ３℃左右，　用蔬菜保鲜烟熏剂处理，每１００　ｍ　使用５００　ｇ，按　（广西桂平市碧滩农业学校５３７２００　郭辉供稿）　【２】Ｌｉ　Ｇ　Ｙ，Ｆｕｋｕｎａｇａ　Ｓ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｇｅｌａｔｉｎ　ａｎｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ａｓ　ＣＯＳ—　Ｄ　产物　ｍｅｔｉｃ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００５（２７）：１Ｏ１—１ｏ６．　【３】赵胜年．酶解鲜猪皮提取水解胶原蛋白的研究【Ｊ１．食品工　业科技，１９９８（５）：１６＂－１７．　［４１　Ｍａｋｏｔｏ　Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｋａｏｒｉ　Ｙａｍａｊｉ－Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ａｃ—　ｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｅｌａｓｔｉｎ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，１９９８　（４６）：２１６７—２１７Ｏ．　【５】Ｚａｉｎｏｌ　Ｍ　Ｋ，Ａｂｄ－Ｈａｍｉｄ　Ａ，Ｙｕｓｏｆ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ａｃ—　ｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｏｆ　ｌｅａｆ，ｒｏｏｔ　ａｎｄ　ｐｅｔｉｏｌｅ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｅｎｔｅｌｌａ　ａｓｉａｔｉｃａ（Ｌ．）ｕｒｂａｎ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ—　图４酶解产物ＳＤＳ—ＰＡＧＥ图谱　ｉｓｔｒｙ，２００３（８　１）：５７５－－５８　１．　【６】陈贵堂．花生蛋白的营养生理功能及其酶解产物抗氧化　３　结论　活性的研究【Ｄ１．硕士学位论文，北京：中国农业大学，２００６．　【７】何忠效．生物化学实验技术【Ｍ】．北京：化学工业出版社，　２００４．　酶解猪皮胶原蛋白制备抗氧化产物的最佳条　件：高温处理猪皮５　ｍｉｎ后，称取绞碎的猪皮６．ｏ０　【８】Ｈｕｉ－Ｃｈｕｎ　Ｗｕ，Ｈｕａ－Ｍｉｎｇ　Ｃｈｅｎ．Ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｅｐ—　ｔｉｄｅｓ　ａｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ　ｇ于１００　ｍＬ　０．５　ｍｏｌ／Ｌ醋酸溶液中，胃蛋白酶用量　ｏｆ　ｍａｃｋｅｒｅｌ（Ｓｃｏｍｂｅｒ　ａｕｓｔｒｉａｓｉｃｕ）『Ｊ１．Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｎａ—　为底物的１．５％，酶解时间为０．５　ｈ。所得产物的分　ｔｉｏｎａ１．２００３（３６）：９４９—－９５７．　９】凌关庭．抗氧化食品与健康【Ｍ】．北京：化学工业出版社，　子量较大，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳条带呈连续分布。酶解　【产物与抗坏血酸相比，没有表现出还原能力，表明　２００４．　Ｏ】王瑛瑶，王璋．花生水解蛋白液的浓缩及体外活性研　产物的抗氧化性主要由于其具有良好的乳化作用　【１与螯合作用。　参考文献：　究［Ｊ】．食品科学，２００７，２８（１）：１７９－－－１８３．　注：戴瑞彤同志为本文通讯作者。　霞．猪皮中胶原蛋白的提取及其应　收稿日期：２００７—０２－－０９　【１】李开雄，赵志远，刘用【Ｊ１．肉类研究，１９９６（４）：４３—４６．