(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112616659 A(43)申请公布日 2021.04.09
(21)申请号 202011472139.8(22)申请日 2020.12.14
(71)申请人 江苏省中国科学院植物研究所
地址 210014 江苏省南京市中山门外前湖
后村1号(72)发明人 周艳威 陈红 张凡 陆小清
李云龙 王传永 李乃伟 蔡小龙 种昕冉 周婷 (74)专利代理机构 南京申云知识产权代理事务
所(普通合伙) 32274
代理人 邱兴天 邢少华(51)Int.Cl.
A01H 4/00(2006.01)
权利要求书2页 说明书4页 附图3页
(54)发明名称
一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法(57)摘要
本发明公开了一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，属于林木细胞工程快繁技术领域。该方法利用大别山冬青自然授粉半同胞家系的果实，分离出未成熟合子胚进行体细胞胚胎发生培养。包括大别山冬青未成熟胚的准备、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织维持与增殖阶段、体细胞胚诱导培养和体细胞胚的萌发、再生植株的炼苗和移栽。本方法繁殖系数高，增殖效果良好，繁殖不受季节限制，解决了大别山冬青播种繁殖需1‑3年时间长的问题，不仅有利于大别山冬青遗传资源的保存，而且为加速大规模冬青属树种无性繁育提供了一种周期短、繁殖率高且成本低廉的方法，也为建立更加高效的大别山冬青遗传转化受体体系提供了参考。
CN 112616659 ACN 112616659 A
权 利 要 求 书
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1.一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采集大别山冬青自然授粉半同胞家系的果实，取发育至早期子叶胚阶段的大别山冬青核果，经表面灭菌后，分离出未成熟合子胚；
2)在无菌条件下，将未成熟合子胚接种至诱导固体培养基中诱导培养获得胚性愈伤组织；
3)在无菌条件下，将步骤2)获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖培养基中形成紧实、致密的胚性愈伤组织；
4)在无菌条件下，将步骤3)获得的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中至子叶胚成熟后，将成熟的子叶胚转移到基本培养基中直至萌发长成完整的再生植株；
5)再生植株的炼苗和移栽。
2.根据权利要求1所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，步骤1)中，在采集大别山冬青自然授粉半同胞家系的果实，分离出未成熟合子胚时，按照如下步骤进行：采集大别山冬青全红果实，置于4℃条件下冷藏保存，然后揉搓去掉果皮和果肉，并在流水下冲洗得到干净的核果；取发育至早期子叶胚阶段的大别山冬青核果，经过75％乙醇和2％次氯酸钠溶液表面灭菌后，在无菌条件下取出合子胚。
3.根据权利要求1所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，步骤2)中，诱导固体培养基的配方为：改良MS培养基+2，4‑D1.0～3mg/L+6‑BA 0.2～0.8mg/L+LH 0.45g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30mg/L+水晶洋菜3g/L。
4.根据权利要求3所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，所述改良MS培养基是以MS基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3 800mg/L，KNO3 700mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 96mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 555.96mg/L。
5.根据权利要求1所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，步骤2)中，诱导培养的条件为：黑暗条件，控温23℃，培养25‑28天。
6.根据权利要求1所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，步骤3)中，维持和增殖培养基的配方为：改良MS培养基+2，4‑D 1.5～3.0mg/L+6‑BA 0.1～0.5mg/L+LH 0.45g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖20～30mg/L+水晶洋菜3g/L。
7.根据权利要求1所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，步骤3)中，维持和增殖培养的条件为：黑暗条件，控温23℃，每隔20天继代一次。
8.根据权利要求1所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，步骤4)中，体胚诱导培养基的配方为：改良MS培养基+2，4‑D 0.5～1.0mg/L+KT 1.0～2.0mg/L+CH 0.5g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖40mg/L+水晶洋菜3g/L；体胚诱导培养的条件为：黑暗条件，控温23℃，培养20～30天。
9.根据权利要求1所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，步骤4)中，将成熟的子叶胚转移到MS基本培养基中，光照3000lx，光照/黑暗的时间为16h/8h，控温23～25℃，直至萌发长成完整的植株。
10.根据权利要求1所述的大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，步骤5)中，在再生植株的炼苗和移栽时，按照如下步骤进行：在再生植株长到4‑6片真叶，高度为5‑6cm后，选择根系发达、生长健壮的再生苗，开瓶驯化，在人工培养室内放置3～
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权 利 要 求 书
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5天；然后取出并洗净根部培养基，移栽至消毒过的珍珠岩∶泥炭土(V∶V)＝1∶2～4的混合基质中。
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说 明 书
一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法
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技术领域
[0001]本发明属于林木细胞工程快繁技术领域，具体涉及一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法。
背景技术
[0002]大别山冬青(拉丁名：Ilex dabieshanensis K.Yao&M.B.Deng)，冬青科冬青属常绿阔叶乔木，原产安徽、湖北等大别山地区，为天然杂交树种，1987年由江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)植物分类专家姚淦和邓懋彬发现并定名，是华东、华中地区重要的园林景观及茶饮、药用经济树种之一。大别山冬青叶色青翠，果实红艳，生长势旺盛，耐修剪，适应性广，对土壤的质地要求不严，山上、露地、微酸均能适应，耐瘠薄，栽培中未见明显病虫害发生，抗旱和耐高温，叶片保健价值高，可作保健饮料、药材等的原料。木材材质优良，可作家具贴面板等。
[0003]目前大别山冬青大规模繁育主要采用播种育苗，由于其种子具有综合性休眠特征，一般发芽需2年以上时间。并且大别山冬青是天然杂交树种，实生后代会产生大量变异，难以保持母株优良性状，不足以短期满足苗木市场的巨大需求。因此，有必要研究大别山冬青优良种质资源快速大量繁殖的技术。而体细胞胚胎发生具有诱导数量多、成苗率高、生长周期短、遗传特性较稳定、不受地区、季节等自然条件的限制等优点，已在230多个科，460多个植物中实现，是目前最具有广阔应用前景的快速繁殖手段。[0004]虽然大别山冬青目前有组织培养相关报道，但其增殖率均不高，仅为4‑6，大别山冬青体细胞胚胎发生技术的建立，不仅可以解决目前传统组织培养增值率低的困难，而且可以实现大量繁殖优质种苗，更有利于优良种质资源的保存、繁殖以及遗传改良等研究。因此，开展大别山冬青体细胞胚胎发生研究，克服现有技术的不足，是十分有必要的。发明内容
[0005]针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法。[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：[0007]一种大别山冬青体细胞胚胎发生与植株再生的方法，包括以下步骤：[0008]1)采集大别山冬青自然授粉半同胞家系的果实，取发育至早期子叶胚阶段的大别山冬青核果，经表面灭菌后，分离出未成熟合子胚；[0009]2)在无菌条件下，将未成熟合子胚接种至诱导固体培养基中诱导培养获得胚性愈伤组织；
[0010]3)在无菌条件下，将步骤2)诱导获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖培养基中形成紧实、致密的胚性愈伤组织；[0011]4)在无菌条件下，将步骤3)获得的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中至子叶胚成熟后，将成熟的子叶胚转移到基本培养基中直至萌发长成完整的再生植株；
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说 明 书
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5)再生植株的炼苗和移栽。
[0013]进一步的，步骤1)中，在采集大别山冬青自然授粉半同胞家系的果实，取发育至早期子叶胚阶段的大别山冬青核果，经表面灭菌后，分离出未成熟合子胚时，按照如下步骤进行：采集大别山冬青全红果实，置于4℃条件下冷藏保存，然后揉搓去掉果皮和果肉，并在流水下冲洗得到干净的核果；取发育至早期子叶胚阶段的大别山冬青果实，经过75％乙醇和2％次氯酸钠溶液表面灭菌后，在无菌条件下取出合子胚，获得无菌合子胚备用。[0014]进一步的，步骤2)中，诱导固体培养基的配方为：改良MS培养基+2，4‑D 1.0～3mg/L+6‑BA 0.2～0.8mg/L+LH 0.45g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30mg/L+水晶洋菜3g/L。[0015]进一步的，改良MS培养基是以MS基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3 800mg/L，KNO3 700mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 96mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 555.96mg/L。[0016]进一步的，步骤2)中，诱导培养的条件为：黑暗条件，控温23℃，培养25‑28天。[0017]进一步的，步骤3)中，维持和增殖培养基的配方为：改良MS培养基+2，4‑D 1.5～3.0mg/L+6‑BA 0.1～0.5mg/L+LH 0.45g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖20～30mg/L+水晶洋菜3g/L。
[0018]进一步的，步骤3)中，维持和增殖培养的条件为：黑暗条件，控温23℃，每隔20天继代一次。
[0019]进一步的，步骤4)中，体胚诱导培养基的配方为：改良MS培养基+2，4‑D 0.5～1.0mg/L+KT 1.0～2.0mg/L+CH 0.5g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖40mg/L+水晶洋菜3g/L；体胚诱导培养的条件为：黑暗条件，控温23℃，培养20～30天。[0020]进一步的，步骤4)中，将成熟的子叶胚转移到MS基本培养基中，光照30001x，光照/黑暗的时间为16h/8h，控温23～25℃，直至萌发长成完整的植株。[0021]进一步的，步骤5)中，在再生植株的炼苗和移栽时，按照如下步骤进行：在再生植株长到4‑6片真叶，高度为5‑6cm后，选择根系发达、生长健壮的再生苗，开瓶驯化，在人工培养室内放置3～5天；然后取出并洗净根部培养基，移栽至消毒过的珍珠岩∶泥炭土(V∶V)＝1∶2～4的混合基质中。[0022]有益效果：本发明的优点为：相比于现有技术，
[0023]本发明是利用大别山冬青自然授粉半同胞家系的果实，分离出未成熟合子胚进行体细胞胚胎发生培养，包括大别山冬青未成熟胚的准备、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织维持与增殖阶段、体细胞胚诱导培养和体细胞胚的萌发、再生植株的炼苗和移栽。本发明首次建立了大别山冬青未成熟合子胚的体细胞胚胎直接再生技术体系，繁殖系数高，增殖效果良好，繁殖不受季节限制，解决了大别山冬青播种繁殖需1‑3年时间长的问题，为大别山冬青遗传改良材料的快速繁殖提供了一种高效途径，不仅利于大别山冬青遗传资源的保存，而且为加速大规模冬青属树种无性繁育提供了一种周期短、繁殖率高且成本低廉的方法，也为建立更加高效的大别山冬青遗传转化受体体系提供了参考。附图说明
[0024]图1为大别山冬青未成熟胚图，箭头所示为未成熟胚；[0025]图2为未成熟胚诱导出的早期胚性愈伤组织图；
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图3为未成熟胚诱导出的胚性愈伤组织图；图4为胚性愈伤组织诱导出的早期胚结构图；图5为成熟子叶胚图；
图6为子叶胚萌发成苗图；
图7为子叶胚萌发形成大别山冬青体胚再生完整植株图；图8为大别山冬青体胚再生完整植株移栽成活苗图。
具体实施方式
[0032]下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，所用实验方法均为常规方法。[0033]实施例1[0034](1)大别山冬青未成熟合子胚的准备[0035]每年10月中旬开始至11月中旬，每隔一周采集一次大别山冬青优良单株上自由授粉约6个月后的红色果实，迅速置于4℃条件下冷藏保存。各时间点所采集果实经过多年观察分别为胚发育成鱼雷胚至早期子叶胚的各个阶段。取出果实，然后用力揉搓去掉果皮和果肉，挤出内部的小核果，然后在流水下冲洗3～5遍，不饱满核果会漂浮于水面，沉入水下为发育良好的核果。核果先经过75％乙醇浸泡45～60秒，然后用2％次氯酸钠溶液灭菌15～18分钟，最后用无菌水冲洗3遍，随后在无菌条件下中，在解剖镜下用无菌手术刀和镊子件下剥掉核果外面的硬质种皮，取出未成熟合子胚，接种于固体诱导培养基中，每培养皿接种8～10粒。[0036](2)胚性愈伤组织的诱导
[0037]胚性愈伤组织起始诱导阶段基本培养基采用改良Murashige and Skoog(MS)培养基。在无菌条件下将未成熟合子胚接种至诱导固体培养基中，黑暗条件，培养25‑28天，控温23℃，可诱导出胚性愈伤组织。诱导胚性愈伤组织固体培养基为：改良MS基本培养基，添加2，4‑二氯苯氧乙酸(2，4‑D)1.0mg/L；6‑苄氨基嘌呤(6‑BA)0.2mg/L；水解乳蛋白(LH)0.45g/L；谷氨酰胺(Glu)0.5g/L；维生素C(Vc)10mg/L；蔗糖30g/L；水晶洋菜3g/L，pH调节为5.6‑5.8。20天左右即可诱导出胚性愈伤，愈伤组织诱导率达100％。。如图2所示为未成熟胚诱导出的早期胚性愈伤组织。[0038](3)胚性愈伤组织维持与增殖阶段
[0039]胚性愈伤组织维持与增殖基本培养基采用改良(MS)培养基。在无菌条件下，将步骤(2)中诱导获得的早期胚性愈伤组织转入维持和增殖固体培养基中，黑暗条件，控温23℃。其中维持与增殖培养基为：改良MS基本培养基，添加2，4‑D 1.5mg/L；6‑BA 0.1mg/L；LH 0.45g/L；Glu 0.5g/L；Vc 10mg/L；蔗糖20g/L；水晶洋菜3g/L，pH调节为5.6‑5.8。20天继代一次，继代两次后会形成淡黄色，紧实、致密的胚性愈伤组织，愈伤组织增值率达3.8。如图3所示。[0040](4)体细胞胚诱导培养和体细胞胚的萌发
[0041]体细胞胚诱导基本培养基采用改良(MS)培养基。在无菌条件下，将步骤(3)中诱导获得的胚性愈伤组织转入体胚诱导固体培养基中，黑暗条件，控温23℃，培养20～30天。其中体胚诱导培养基为：改良MS基本培养基，添加2，4‑D 0.5mg/L；激动素(KT)1.0mg/L；CH
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0.5g/L；Glu 0.5g/L；Vc 10mg/L；蔗糖40g/L；水晶洋菜3g/L，pH调节为5.8。经过15‑20天即可看到胚性愈伤组织表明形成胚状结构，胚性愈伤组织诱导率达88.62％，30天左右发育至子叶胚。图4‑5所示。
[0042]萌发基本培养基用改良(MS)培养基。经过上述4个步骤之后，子叶胚达到成熟，将成熟的子叶胚转移到固体MS基本培养基中，光照30001x，光照时间为16h/8h(光照/黑暗)，控温23～25℃，30天左右萌发长成完整的植株，如图6‑7所示。其中胚萌发固体培养基为：MS基本培养基，添加Vc 10mg/L；蔗糖30g/L；水晶洋菜3g/L，pH调节为5.6‑5.8。[0043](5)再生植株的炼苗和移栽[0044]再生植株长到4‑6片真叶，高度为5‑6cm后，选择根系发达、生长健壮的再生苗，先将瓶盖打开，在人工培养室内放置3～5天。然后取出并洗净根部培养基，移栽至消毒过的珍珠岩(V)∶泥炭土(V)＝1∶4的混合基质中，成活率可达90％以上。如图8所示为栽植成活大别山冬青体胚再生植株。
[0045]上述改良MS培养基的配方为：NH4NO3 800mg/L，KNO3 700mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 170mg/L，CaCl2·2H2O 96mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 555.96mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·4H2O 6.9mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，FeSO4·7H2O 27.80mg/L，Na2‑EDTA·2H2O 37.30mg/L，肌醇100.00mg/L，烟酸0.50mg/L，甘氨酸2.00mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L。[0046]实施例2
[0047]步骤(2)中，诱导固体培养基配方为改良MS基本培养基，添加2，4‑D 2.0mg/L，6‑BA 0.4mg/L。步骤(3)中胚性愈伤维持与增殖培养基为改良MS基本培养基，添加2，4‑D 2.0mg/L；6‑BA 0.3mg/L。步骤(4)中体胚诱导培养基为为改良MS基本培养基，添加2，4‑D 0.5mg/L；KT 1.0mg/L。其余步骤和控制条件均保持与实施列1中所述一致。[0048]实施例3
[0049]步骤(2)中，诱导固体培养基配方为改良MS基本培养基，添加2，4‑D 3.0mg/L，6‑BA 0.8mg/L。步骤(3)中胚性愈伤维持与增殖培养基为改良MS基本培养基，添加2，4‑D 3.0mg/L；6‑BA 0.5mg/L。步骤(4)中体胚诱导培养基为为改良MS基本培养基，添加2，4‑D 1.0mg/L；KT 2.0mg/L。其余步骤和控制条件均保持与实施列1中所述一致。
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