青霉素菌的分离和筛选

土壤中青霉素菌的分离和筛选 （一）实验目的

1、了解采集土样的要求和方法。

2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。 3、学习并掌握微生物的纯培养技术。 (二)实验原理

采用适宜(选择)培养基和培养条件，或加入某种抑制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法在固体培养基上形成单个菌落。抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质青霉素属于青霉素类抗生素，干扰细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用。

（三）实验材料

1含菌种的土壤，学校旁边的土层中获取 2.复筛实验菌种：金黄色葡萄球菌，曲霉

3.培养基和试剂：高氏一号培养基，高氏一号初筛培养基（含青霉素），试剂：青霉素，钾，氯化钠，重铬酸钾，

4.实验器材：无菌试管，烧杯，移液管，三角瓶,天平,接种环，高压锅灭菌锅,显微镜.

（四）实验步骤 1.培养基配制

①：高氏一号改良培养基：可溶性淀粉20g，钾1g,氯化钠 0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，终浓度为50×10-5重铬酸钾，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。冷却后，倒致平版数个。

②：初筛培养基：改良高氏一号培养基（在原来配置的高氏一号琼脂培养基灭菌后，再分别加入青霉素终浓度为10-3，10-4，10-5的药剂），倒致平版数个

2.样品采样：取样时应取土壤表层下5～10cm处土样，干后混匀； 3 制备稀释液：

（1）. 称取土壤1g（或量取1nl水样），放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－2的土壤悬液。

（2）另取装有无菌试管5支，用记号笔编上10-3、10－4、10－5、10－6、10－7。在每只试管中用无菌吸管加入4.5ml无菌水。（3）取已稀释成10－2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取0.5mL土壤悬液加入10－3的无菌水的试管中，即成10－3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4→10 -5→10-6土壤稀释液。4：平板涂抹：取无菌培养皿，将上述每种培养基平板底面标记

稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用无菌三角玻璃棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。

5：培养：将接种后的培养基静置10min后，倒置于28～30℃条件下培养3～4d.

6.青霉菌的初筛：

选取菌落生长良好，排布均匀的培养基，用接种环分别均匀（3至5处）挑取培养基中的菌落，在无菌条件下分别接种于初筛培养基中，倒置于28～30℃条件下培养3～4d。

7：青霉菌的复筛 1.纯培养菌落获得：

选取经初筛后，生长状态良好的单菌落，在无菌条件下，用接种环挑取菌落接种于发酵培养基中，于25℃培养24h取经过24h 发酵后的生长状态良好的菌株，接种到高氏一号改良培养基中保存。

8. 青霉素抗菌谱检测

1.培养基配制：高氏一号筛选培养基：可溶性淀粉20g，钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，

FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。冷却后，向其中加入实验菌种（金黄色葡萄球菌，曲

霉）制作数个平板，

2.青霉菌菌种接种：切取一定大小的青霉菌琼脂培养块，置于含菌平板上，于28~30℃培养3-4d。

3.结果观察:观察在实验条件下培养下，敏感菌生长状态和是否有抑菌圈产生

9.青霉素定性检测

1.标准样品制备：吸取青霉素标准溶液1ml于试管中，加入0.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5％钼酸铵

2.0ml，8％Na2HPO41.0ml，加入发酵培养基至20ml，摇匀，于沸水中加热20min。取出冷却，摇匀。

2.试验品制备：取出0.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5％钼酸铵2.0ml，8％Na2HPO41.0ml 于试管中，标号。加入经过发酵后的发酵培养基至20ml，摇匀，于沸水中加热20min。取出冷却，摇匀。

3.空白样品制备：取出加入0.2mol/L的Na(OH)溶液0.5ml，1.0mol/LH2SO4溶液1.0ml，5％钼酸铵2.0ml，8％Na2HPO41.0ml，加入发酵培养基至20ml，摇匀，于沸水中加热20min。取出冷却，摇匀。

分光检测：分别以空白样品和标准样品作为对照，在720nm 处测定吸光度。

10.革兰氏染色

1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染1分钟。3）自来水冲洗。4） 加碘液覆盖涂面染约1分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

观察实验结果，对照《伯杰细菌手册》查找所分离出的抗生素产生菌的属。