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药学分子生物学

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第一章 基因与基因组

基因 (gene) :是指合成有功能的蛋白质、多肽或RNA所需的全部DNA序列(除部分病毒RNA),是基因组的一个功能单位。 基因组(genome):是指生物体一套完整的单倍体遗传信息的总和,包括所有基因和基因间的区域。

基因组的主要功能是贮存和表达遗传信息,是物种及其个体之间区别和联系的最本质生物学特征。

基因组学(genomics):是研究生物基因组的结构、功能及表达的一门科学。 序列(顺式作用元件):一个基因的区和其结构基因位于同一个DNA分子的相邻部位,这种调节方式称为顺式调节,相应的DNA序列成为顺式作用元件。

(1)启动子:RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。 (2)增强子:能强化转录起始的一段DNA序列。(3)沉默子(4)终止子。

反式作用因子:通过识别或结合顺式作用元件上的核心序列从而参与基因转录的蛋白质。也称转录因子。 原核生物基因组结构特点: 1. 具有类核结构

2. 以操纵子为功能单位/多顺反子mRNA

3. 结构基因大多为单拷贝,编码序列一般不重叠 4. 结构基因大多没有内含子 5. 非编码序列比例约为一半 6. 含可移动 DNA 序列 操纵子(operon)

 操纵子是原核生物的一段DNA序列,由几个串联排列的功能相关的结构基因,加

上调节序列组成的一个完整的连续的功能单位。  操纵子结构通常与启动子区域有部分重叠,可通过代谢物与调节蛋白相互作用而激

活或抑制基因转录,这是原核生物最常见的转录调节方式。

真核生物基因组结构特点

1. 基因组庞大,为线状双链DNA 2. 断裂基因

3. 非编码区与单顺反子 4. 大量重复序列 5. 基因家族与假基因

断裂基因(split gene):真核生物结构基因由外显子与内含子间隔排列,内含子在转录后被剪切掉。

基因家族(multi gene family):是来源相同,结构相似,功能相关的一组基因,由某一共同祖先基因经重复和突变产生。 假基因(pseudogene):与具正常功能基因序列相似,但无转录功能或其转录产物无功能的基因。

人类基因组计划(HGP) HGP的主要目标:

• 遗传图谱:基因或DNA标记在染色体的相对位置与遗传距离。 • 物理图谱:一级结构上两个DNA片段之间的实际距离。 • 序列图谱:基因组DNA的全部核苷酸序列。

• 转录图谱:正常或受控条件全基因表达的时空图。

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HGP的意义:

• 鉴定人类全部基因,推动生物技术发展。 • 理解疾病与基因的关系。 • 推动模式生物研究。

• 促进多学科发展与交叉融合。 不同生物基因组结构特点: 病毒 基因组较小,只含一种核酸 (DNA或RNA) 含有重叠基因 存在转录单元 原核生物 真核生物 具有类核结构、通常一条环基因组庞大,为多条线状双链状双链DNA分子(基因组、DNA(细胞核、细胞器DNA) 质粒DNA) 以操纵子为功能单位(多顺反子mRNA) 结构基因大多为单拷贝,编码序列一般不重叠 断裂基因 非编码区远多于编码区 单顺反子 噬菌体基因连续,感染真 结构基因大多没有内含子、存在大量重复序列 核细胞的病毒基因不连续 是连续的 编码序列占绝大部分 主要为单拷贝序列 (反转录病毒含有两个拷贝) 非编码序列比例约为一半 含可移动 DNA 序列 (转座子) 基因家族与假基因 DNA末端具有端粒结构 蛋白质组(proteome):一个细胞、一个组织或者一个有机体的基因组表达的所有蛋白质。 蛋白质组学(proteomics):阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。

第二章 PCR、核酸杂交、基因芯片

PCR基本原理:以待扩增的DNA为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶作用下,以dNTP为底物,按照半保留复制的原理,通过变性、退火、延伸三个步骤完成新的DNA合成,并反复重复这一过程。 PCR反应步骤:

高温变性:94℃ 获单链模板

低温退火:55℃ 引物结合单链模板 适温延伸:72℃ DNA新链合成

PCR反应体系:DNA 模板、引物(决定PCR反应特异性)、耐热DNA聚合酶、dNTP、缓冲体系 一、二价阳离子 PCR与DNA复制的比较: 相同点:

 DNA合成反应  DNA聚合酶参与  需要引物

 4种dNTP为原料 不同点:

 体外反应

 仅合成特定DNA片段(由1对引物限定)  变温条件下进行

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 仅一种耐热的DNA聚合酶参与  DNA引物  循环多次

PCR反应体系的优化:特异性、有效性、忠实性 1、DNA聚合酶:耐高温、保真性、激活剂 2、模板DNA:种类、用量 、质量 3、dNTP: 浓度一致、稳定

4、DNA引物:决定PCR扩增产物的特异性和长度。

引物设计一般遵循的原则:长度;碱基随机分布; 避免引物间、引物自身互补;引物的3’端不能修饰、不应错配;两条引物之间退火温度不大于5 oC。 PCR技术的应用 1) 基因克隆 2) 基因检测

(1) PCR产物的性片段长度多态性分析 (PCR-RFLP)

基因突变会导致基因序列中产生新的性核酸内切酶位点或使原有性核酸内切酶位点消失。 因此,突变基因经相应的性核酸内切酶水解后,其电泳条带的数量和大小就会发生改变,根据这些改变可以判断突变是否存在,即性片段长度多态性技术。 (2) PCR产物的单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)

 基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA由于碱基组成

或排列顺序不同,形成不同的构象。

 利用PCR扩增目的基因片段,通过变性成为单链,然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶

电泳,单个核苷酸的改变会造成单链DNA片段构象的改变,其迁移率随之改变,从而检测基因的突变。

(3) PCR产物的等位基因特异性寡核苷酸探针杂交 (PCR-ASO) 采用PCR扩增受检者基因的目标片段,并与相应的ASO探针杂交。

针对已知突变位点的基因,设计一对寡核苷酸探针,其中一条为野生型探针(N),与正常序列互补,另一个为突变型探针(M),突变碱基应位于探针的,与突变序列互补。 PCR衍生技术 (一)巢式PCR

(二)逆转录PCR (RT-PCR)

先将RNA用反转录酶反转录成cDNA,然后再加入特异引物对目标片段进行扩增,扩增产物的分析与普通PCR类似。

反转录酶:AMV和MoMLV反转录酶

反转录引物:随机引物、Oligo (dT)、特异性引物 用途:检测基因表达水平;检测RNA病毒 (三)多重PCR

在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段的方法。 优点:多个致病基因同时检测。 (四)定量PCR 实时荧光定量PCR

在PCR反应体系中加入反应PCR扩增进程的荧光染料或荧光标记探针,实时监测PCR过程中荧光信号的变化,通过参照基因或标准曲线对起始模板DNA的浓度进行精确定量分析。 实时荧光定量PCR原理

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 如何对起始模板定量?

通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析

 三个基本概念: 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线图:

横坐标:扩增循环数(Cycle); 纵坐标:荧光强度

 荧光染料:SYBR Green I 核酸分子杂交

原理:核酸变性与复性 核酸分子杂交技术

用标记的已知序列的核酸片段(探针)来检测样品中未知核酸序列(形成异源杂交体),再经显影或显色的方法,将结合的核酸的位置或大小显示出来。 核酸探针(probe)

能与待测的靶核酸序列特异性互补杂交,杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核酸片段。

核酸探针类型

 DNA探针: 基因组DNA探针;cDNA探针; 寡核苷酸探针  RNA探针 核酸探针标记物

 放射性标记物:32P, 3H ,35S

灵敏度高; 但存在环境污染和半衰期短等缺点。

 非放射性标记物: 生物素、光敏生物素、地高辛、酶、荧光素等,但灵敏度和特异

性较放射性标记物差。

核酸分子杂交技术应用

 固相杂交

印迹杂交 (blotting hybridization):Southern blot、Northern blot 斑点杂交 (dot hybridization) 原位杂交 (in situ hybridization)

 液相杂交

印迹杂交的一般步骤: 1. 样品制备和电泳分离 2. 样品变性处理、转印 3. 探针制备和标记 4. 预杂交与杂交

5. 洗去未杂交的游离探针 6. 检测杂交信号 7. 结果判断与分析 印迹技术(blotting)

将核酸或蛋白质等生物大分子通过一定方式转移并固定到固相支持物上以便进一步分析的方法。

1. Southern blot (DNA检测)

通过核酸内切酶降解样品中DNA,再经凝胶电泳分离,将分离后的DNA片段从凝胶转移到吸附薄膜上并固定,随后用标记的探针进行杂交,以检测目的DNA。

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步骤:1.DNA片段分离变性 2.DNA片段转移与固定 3.杂交反应 4.杂交信号检测 2. Northern blot(RNA检测)

RNA经变性凝胶电泳分离后,转移固定到固相支持物上,与标记的探针杂交并检测。(分析基因的转录和mRNA分子的大小)。 3. Western blot(蛋白检测) 基本原理:通过电泳区分不同的蛋白组分,并转移至固相支持物,通过特异性抗体作为探针,对靶蛋白(抗原)进行检测。也称为免疫印迹(immunoblotting)。

主要用途:1. 鉴定蛋白质表达情况 2. 比较不同样本中特定蛋白质相对表达量 3. 分析蛋白-蛋白间相互作用(蛋白质组学研究) 三种印迹技术的共同点

基本步骤相同(电泳、转印、杂交反应、杂交信号检测) 三种印迹技术的不同点 检测对象 凝胶种类 预处理 (变性剂) 检测探针 Southern Blot DNA 琼脂糖 Northern Blot RNA 琼脂糖 Western Blot 蛋白质 聚丙烯酰胺 热变性 SDS 抗体 性酶切NaOH 甲醛 DNA cDNA 原位杂交:在保持细胞形态的条件下,检测与探针互补的核酸序列在细胞内的空间位置。 荧光原位杂交

采用荧光标记的探针与待测样本中的核酸进行原位杂交,从而检测核酸序列在组织或细胞中的定性、定位及相对定量。 遗传性疾病的产前诊断

荧光原位杂交筛选21三体(间期)

FISH检测白血病细胞BCR-ABL融合基因

荧光原位杂交检测上皮细胞中人乳头瘤病毒的感染 基因芯片(gene chip)

• 将大量探针有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探针,然后

与标记的待测核酸样品进行杂交,通过对探针分子杂交信号强度的分析来获知样品中相应分子的数量和序列信息。

• 由于常用计算机硅芯片作为固相支持物,所以称为基因芯片。 蛋白质芯片

• 高通量的蛋白质功能分析技术,用于分析蛋白质表达谱,研究蛋白质间或蛋白质与

其他分子间相互作用,筛选药物作用蛋白靶点。

• 基本原理:将各种蛋白质有序地固定于载体上成为检测用的芯片,然后用标记的蛋

白质或其他成分与芯片作用,洗去未结合的成分,再利用扫描技术测定芯片上各点的荧光强度,来分析蛋白质间或蛋白质与其他分子之间的相互作用关系。

三、基因克隆、表达和

基因克隆 五个基本部分:

一、目的DNA的分离获取(分); 二、载体的选择与酶切(切); 三、目的DNA与载体连接(连);

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四、重组DNA转入受体细胞(转); 五、重组体的筛选与鉴定(筛)。 (一)目的基因的获得 ①化学合成

②基因组文库与cDNA文库:包含全面的基因和mRNA信息 基因组文库(genomic library,G-文库)

是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。 cDNA文库(cDNA library,C-文库)

以细胞全部mRNA经逆转录,制备出全套的cDNA克隆集合。 ③利用PCR及RT-PCR扩增技术合成序列已知的基因 ④其它技术

(二)目的基因与表达载体的重组 载体(vector):携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。 按功能分:克隆载体;表达载体 多克隆位点(MCS):一段人工合成的DNA序列,含有密集排列的多种性内切酶识别序列,以便不同来源的外源DNA片段插入载体。

1. 性核酸内切酶

识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的一类核酸内切酶,为原核生物所特有。 分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类

基因工程技术中常用的是Ⅱ类(分子剪刀),

识别位点与切割位点序列特异,且在识别序列内切割 2. DNA连接酶(基因工程的“缝纫针”)

一种封闭DNA链上缺口的酶,催化DNA链相邻的3’羟基与5’磷酸基团生成磷酸二酯键。 3、目的基因与载体重组及其策略 (一) 粘性末端连接

缺点:载体自身环化;双向插入;

碱性磷酸酶(ALP)催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基团。 主要用途有:防止载体DNA自身环化,提高重组效率。

(二) 定向克隆:使目的基因按正确方向插入载体中的方法。 定向克隆的两种连接方式:粘-粘 连接:粘-平 连接 (三)人工接头(linker)

化学合成的含一种或多种酶切位点的平端双链寡核苷酸片段。 本法适用于在载体和目的基因上没有相同的酶切位点 (四)同聚物加尾连接

本法适用于在载体和目的基因上没有相同的酶切位点 (五) PCR引入粘性末端后连接

可在PCR扩增目的基因时将性酶切作用位点人为添加到引物的5’末端。

以目的基因为模板,经PCR扩增获得带有引物序列的目的基因,用相应的性核酸内切酶切割后,产生粘性末端,随后与载体(也经相应的性核酸内切酶切割)进行粘性末端连接。

基因克隆中常用的工具酶

1、性核酸内切酶——用于切割DNA片段 2、DNA连接酶——用于催化DNA片段连接

3、碱性磷酸酶——去除核酸分子末端的磷酸基团

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4、末端转移酶——介导DNA末端加尾,产生酶切作用位点 5、DNA聚合酶——常用于PCR扩增DNA 6、逆转录酶——以RNA为模板合成cDNA 转化:将重组质粒导入受体细胞

转染或称为转导:将噬菌体重组子或病毒重组子导入受体细胞

质粒:是在细菌内除染色体之外的能自主复制到的共价闭合环状双链DNA,随着细菌能够稳定地把自己的遗传特性传递给子细胞。 重组体的筛选和鉴定

阳性克隆:含有目的基因的宿主细胞克隆。 筛选出含有重组DNA(目的基因+载体)的克隆 阳性克隆的筛选方法

(一)针对载体携带的筛选标记 根据遗传表型进行筛选

 抗生素抗性筛选  遗传标记补救筛选  噬菌斑筛选

(二)针对重组体结构和表达产物筛选 基因工程技术的应用:

1. 制备基因组文库、cDNA文库、核酸探针、基因工程药物、疫苗及抗体 2. 制造转基因动植物(改良生物性状) 3. 基因诊断、基因治疗

基因工程生产胰岛素药物流程:

1,目的基因的获取:通过各种手段(基因组文库,化学合成,PCR技术等)获取胰岛素基因。

2,基因表达载体的构建:用酶切割质粒和目的基因(胰岛素基因)使产生不同的粘性末端,再用DNA连接酶使质粒和胰岛素基因连接形成重组质粒。

3,将重组质粒导入受体细胞(如大肠杆菌,用感受态细胞法即CaCl2转化法),筛选阳性重组体。

4,将含有胰岛素基因的阳性重组体在宿主细胞内进行诱导表达、检测、并纯化表达产物。 RNA干扰 :在生物体细胞内,双链RNA分子诱导同源 mRNA特异性降解,导致基因表达抑制,又称转录后基因沉默。 RNA干扰作用机制

(1)siRNA形成:dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA (2)RISC (RNA-induced silencing complex)形成

(3)RISC 活化:siRNA解旋成为单链,无活性的RISC转变成活性形式 (包含siRNA反义链)

(4)诱导靶mRNA降解:在siRNA反义链引导下,RISC识别并切割与siRNA反义链互补的靶mRNA

(5)dsRNA的再生成

细胞中存在两种RNA干扰现象:

siRNA (小干扰RNA):21-23nt,由长dsRNA裂解而成的小片段,可诱导mRNA降解。siRNA主要参与抵御外源性病毒核酸的侵染。

miRNA (微小RNA):约22nt,由miRNA前体剪切而成,可抑制mRNA翻译。 miRNA主要参与内源性基因的表达调节。

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来源 结构 Dicer酶 加工过程 作用位置 作用方式 siRNA (小干扰RNA) siRNA是外源性的, 是RNA干扰的中间产物 siRNA是双链RNA 对称地来源于双链RNA miRNA (微小RNA) miRNA是内源的 是生物体固有 miRNA是单链RNA 不对称加工,仅剪切miRNA的侧臂 siRNA可作用于mRNA的任何部位 miRNA主要作用于靶标基因 3′端非翻译区(3’-UTR) siRNA一般导致靶mRNA的降解,miRNA可抑制靶mRNA的翻译,也可即为转录水平后。 以导致靶mRNA降解,即在转录后水平和翻译水平起作用 siRNA不参与生物生长, 主要作用是抑制病毒感染 miRNA主要在发育过程中起作用,调节内源基因表达 作用阶段 RNA干扰技术的应用

 基因治疗(基因失活性治疗)

(1)病毒感染性疾病:通过RNAi抑制 RNA病毒的复制 (2)基因过表达引起的疾病(如肿瘤):siRNA药物

 基因功能研究(功能失活策略) 基因失活性治疗:

将特定的反义核酸(反义RNA、反义DNA)、核酶、siRNA、miRNA等导入细胞,在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达。 基因失活性治疗面临的问题:

1. 药物的稳定性2. 药物的安全性3. 药物的转运载体

基因靶向:利用同源重组原理对生物细胞特定的内源基因进行改造的技术。

基因敲入:外源功能基因与宿主基因组中的同源序列进行同源重组,插入到基因组中,从而在细胞内获得表达。

基因敲除:宿主基因组中特定功能靶基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代,从而使靶基因失活

第七章 药物基因组学

药物基因组学:是研究遗传变异与药物反应相互关系的一门学科,以提高药物的疗效及安全性为目标。

单核苷酸多态性 (SNP):在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 SNP:是RFLP、STR之后的第三代遗传标记。

SNP特点:1. 最常见可遗传变异;2. 数量多分布广;3. 具有遗传稳定性;4. 具有二态性,易于自动化规模化分析;5. 可直接影响基因功能

SNP检测技术:1. PCR技术;2. 核酸杂交技术;3. 生物芯片技术;4. DNA测序技术。 单体型:位于一条染色体特定区域的一组相互关联,并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态组合。

遗传变异与药物应答

(一)基因多态性与药物代谢 (二)基因多态性与药物转运

(三)基因多态性与药物效应靶分子

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基因分型指导临床用药

随着药物基因组学研究对多种基因多态性与药物应答关系的逐渐阐明,随着各种基因检测和基因分型技术的快速发展,特别在肿瘤、心血管疾病等的治疗方面,多种基因分型已经或正在走向临床,为临床个体化合理用药提供有益的参考信息。

肿瘤化疗药物 5-氟尿嘧啶(5-FU)通过干扰DNA合成发挥抗肿瘤作用。在二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的作用下,被还原为5-氟尿二氢啶而失活。

高水平DPD活性:降低治疗效果,缩短生存期。缺乏DPD:5-FU治疗产生严重的毒副作用。

5-FU用药之前进行DPD基因分析,指导给药方案 药物基因组学与药物研发

一、指导有效药物靶分子的发现和药物设计 (一)靶分子筛选和功能研究 (二)靶向药物的设计和开发 (三)靶分子诊断试剂研发 二、开创临床试验新模式

(一)指导临床试验设计和有效病例筛选 (二)加速新药研发进程;

(三)提高药物研发成功率。 三、药物审批与合理用药

(一)药物基因组学资料呈递 (二)药物标签与合理用药指导。

药物转录组学

反义药物: 反义寡核苷酸药物, 人工合成长度为10-30个碱基的DNA分子及其类似物,其可与靶mRNA 或靶DNA互补杂交,抑制或封闭致病靶基因的表达(包括诱导靶mRNA降解)。

反义药物与传统药物的性质和作用对象明显不同: 1. 新的化学物质:核酸(传统药物的化学本质?) 2. 新的药物受体:mRNA或DNA 3. 新的受体结合方式:碱基配对

4. 新的药物受体结合后反应:如RNA酶降解靶RNA 反义药物特异性更强 !

药物蛋白质组学

蛋白质组学主要研究技术

1、蛋白质的分离:双向凝胶电泳技术 2、蛋白质的鉴定:生物质谱

3、蛋白质-蛋白质的相互作用:蛋白质芯片、酵母双杂交 药物蛋白质组学及应用 药物蛋白质组学:通过对比正常状态和病理状态的细胞或组织的蛋白质组表达差异,用于药物作用机制、药物不良反应的研究或药物治疗前后蛋白质表达状况的分析,以探讨药物类似物的结构与功能关系,发掘新的药物靶点。

应用:1.构建分子药理筛选模型:分子细胞、组织器官、整体动物水平 2.药物靶点的发现、验证和优化 3.药物作用机制研究 4.药物毒理机制研究 5.耐药机制研究

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