骨质疏松小鼠模型骨髓间充质干细胞特性的研究

Published online www.wanfangdate.com.cn tloi：10. 3969/j.issn. 1006-7108. 2019. 12. 001

1669

•论著•

骨质疏松小鼠模型骨髓间充质干细胞特性的研究

汤贤春涂雪芹张天霞李姣•

遵义医科大学细胞生物学教研室，贵州遵义563000

中图分类号：Q25 文献标识码：A 文章编号：1006-7108(2019) 12-1669-07

摘要：目的探讨骨质疏松小鼠模型骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cellS，MSCS)生物学特性的改变。方法通过皮下 注射地塞米松构建小鼠骨质疏松动物模型（0P组），同时设立对照（NC组），分离0P组及NC组骨髓MSCs进行体外培养；通 过流式细胞术检测细胞表面分化抗原；运用CKK-8实验检测细胞增殖活力；通过脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末 端标记法（TUNEL)检测细胞凋亡水平；运用碱性磷酸酶（ALP)活性检测、油红0染色及Western blot法检测两组细胞成骨分 化及脂肪分化能力。结果经过骨组织学检测证明模型建立成功，体外培养〇P组及NC组骨髓MSCs细胞形态无差异。0P-

MSCs细胞表面分化抗齒Scall及CD44为阳性，CD34及CDllb为阴性，与NC-MSCs相似，但OP-MSCs增殖活力下降（尸<0.05);此外两组细胞凋亡水平类似（P>0.05)。成骨分化诱导7 d后OP-MSCs的ALP活性显著低于对照组（P<0.01)，21 d 后矿化小结明显减少（PcO. 〇〇丨）；脂肪分化诱导8 d后OP-MSCs形成更多脂滴（P<0. 05)。Western blot结果显示OP-MSCs在 成骨分化中低表达转录因子以狀2(/?<0.05)及0办1^(/><0.001)，但在脂肪分化早期高表达？？八1^7(户<0.001)及（：/^8?«

(/><0. 01)。结论骨质疏松小鼠骨髓MSCs的增殖及分化潜能显著下降。

关键词：骨质疏松；间充质干细胞；细胞增殖；细胞分化

Research of biological properties of MSCs from osteoporotic mouse model

TANG Xianchun，TU Xueqin，ZHANG Tianxia，LI Jiao*

Department of Cell Biology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China * Corresponding author： LI Jiao, Email： owllj@ 163.comAbstract： Objective

This work discussed the changes of biological characters of mesenchymal stem cells (MSCs) in a

osteoporotic mouse model. Methods Osteoporotic mouse model (OP group) and negative control ( NC group) were established by subcutaneous dexamethasone ( Dex) and saline injection, respectively. MSCs isolated from bone marrow of both groups were cultured in vitro. Flow cytometry was used to detect cell surface markers. The proliferation rate of MSCs was detected by CKK-8 assay. Cell apoptosis was detected by TUNEL assay. ALP activity assay, oil red O staining and western blot assay were used to detect the osteogenic and adipogenic properties of MSCs from both groups. Results

Bone morphologic analysis showed that

osteoporotic models had been successfully established. No difference was observed in cell morphology of MSCs isolated from bone marrow of OP and NC groups. Like NC-MSCs, OP-MSCs were Scall and CD44 positive, but lowly expressed CD34 and CD lib. The proliferation rate of OP-MSCs was significantly lower than NC-MSCs (P<0. 05). However, no significant difference was noted in the apoptosis rate of MSCs from both OP and NC groups (/>>0. 05). We further found that OP-MSCs had much lower ALP activity (P<0. 01) , and formed much less mineralized nodules during osteoblastic differentiation (尸<0. 001). However, more lipid droplets were noticed in OP-MSCs during adipocytic differentiation (^<0. 05). The Western blot result showed that osteoblastic transcription factors Runx2 (P<0. 05) and Osterix (尸<0.001) were lowly expressed in OP-MSCs during osteoblast differentiation. However, the expression levels of PPAR7 (P< 0.001 ) and C/EBPct (P< 0.01) were significantly higher in OP-MSCs during adipocyte differentiation. Conclusion The proliferation and differentiation properties of osteoporotic MSCs were significantly

down-regulated.

基金项目：国家自然科学基金（81660376);贵州省教育厅青年科技人才成长项目[黔教合KY字（2016) 194];遵义医学院大学生创新训练 计划项目[遵义科院（2〇15)3116,遵义科院20162302]

* 通信作者：李姣，Email:owllj@ 163.com

1670

中国骨质疏松杂志 2019 年 12 月第 25 卷第 12 期 Chin J Osteoporos，December 2019, Vol 25，No. 12

Key words： osteoporosis； mesenchymal stem cell； cell proliferation； cell differentiation

随着人口老龄化程度的加剧，骨质疏松症的发 病率逐年上升，目前尚无有效的治疗方法m。该病 病因复杂，衰老、雌激素水平下降、糖皮质激素类药 物的使用以及生物应力[24)下降都能导致骨质疏 等剂量生理盐水。

1.2.2 骨组织学检测：采用腹腔注射水合氯醛 (5%,注射剂量0.25 mL/g)麻醉小鼠后，将其四肢 展开于双能X线吸收测量仪（Lunar公司）平台上， 松。虽然各类骨质疏松的发病机理不同，但都表现 为骨重建平衡的破坏，即骨形成减少，而骨吸收增 加[5_6]。因此促进新骨形成以补充丢失的骨组织是 从根本上治疗此类疾病的关键。骨髓间充质干细胞

(mesenchymal stem cells, MSCs)分化形成成骨细胞

并进一步形成骨细胞，是机体内骨组织更新的唯一 途径。导致骨质疏松的许多因素都能抑制成骨细胞 的分化，因而MSCs向成骨细胞的分化成为骨 质疏松领域的研究热点[7<。

干细胞的生物学特性会受到其周围微环境的精 确[9]。骨质疏松患者的骨髓微环境受到严重 的影响[1°],极有可能影响了 MSCs的生物学特性， 导致其难以分化为成骨细胞。然而相关研究却未见 报道。本研究以地塞米松（dexamethasone, Dex)诱 导的骨质疏松小鼠为模型，分离其MSCs来系统研 究其增殖、迁移、分化、凋亡等生物学特性，并通过与 正常MSCs的比较，探讨骨质疏松MSCs生物学特性 的改变及其对新骨形成的影响。

1材料与方法

1. 1

实验动物及材料

SPF级C57BL6/J小鼠（雄性18只，4~6周龄，

体重20~25 g)购自上海斯莱克实验动物有限公司 [许可证号SYXK(沪）2013-0062]。DMEM高糖培 养基、胎牛血清（FBS)、胰蛋白酶均购自Hyclone公 司；荧光标记抗CD34、CD44、Scall及CDllb抗体购 自BD Pharmingen公司；Dex、抗坏血酸、(3-憐酸甘 油、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、茜素红、油红0 均购自Sigma公司；TUNEL染色试剂盒、碱性磷酸 酶（ALP)检测试剂盒、CKK-8检测试剂盒均购自碧 云天公司；抗Runx2抗体、抗Osterix抗体、抗C/

EBPa抗体购自Abeam公司；抗PPAR\"y抗体购自 Cell Signal Technology 公司。

1.2方法

1.2.1动物模型建立：小鼠适应性培养1周后随机 分为两组：骨质疏松模型组（0P组）及对照组（NC 组），每组6只。0P组小鼠按50 mg/kg体质量皮下 注射Dex,每天1次，持续5周。NC组小鼠注射同

通过小动物软件测定系统测定各组小鼠胫骨近心端 骨密度（bone mineral density, BMD)。将小鼠处死 后剥离股骨，用4%多聚甲醛固定，经脱钙、脱水后 常规石蜡包埋，做5 pm连续切片。骨组织切片经 苏木素-伊红（H&E)染色后观察骨组织形态。1.2.3 MSCs分离培养：将小鼠处死后于无菌环境 下分离其双侧股骨、胫骨，分别剪去骨骺两端，用 5 mL无菌注射器吸取DMEM高糖培养基冲出骨髓， 离心收集，裂解红细胞后接种于含有10%胎牛血清 的DMEM高糖培养基中，于37 ^、5% C02培养箱 内培养。3 d后换液除去未贴壁细胞，贴壁细胞传 代3次后用于实验。

1.2.4流式细胞术：各组第4代MSCs长至85%汇 合度时，消化收集，将细胞用培养液稀释至5 xl〇5 个/mL,并分装于EP管中，每管0.5tnL。按说明书 每管分别加人荧光标记抗CD34、CD44、Scall及

CDllb抗体，室温避光孵育1 h,PBS洗3次后将细

胞重悬于200 pL PBS中，运用流式细胞仪Cytomics

FC 500 (Beckman Coulter公司）分析。每份样本分

析lxl〇4个细胞，用软件Flow Jo Ver.10计算阳性细 胞百分比。

12.5 细胞增殖测定：细胞增殖测定采用CKK-8 法。取第4代MSCs接种于96孔板（每孔5 000个 细胞），设5个复孔。细胞贴壁培养12 h后计时为 〇,继续培养6、12、24、48 h。每孔加人CKK-8试剂， 培养箱中反应2 h后，在分光光度计上检测对应细 胞孔450 rnn波长处的吸光度（D)值，并根据培养时 间和吸光度值绘制细胞增殖曲线。

1.2.6细胞凋亡测定：培养第4代MSCs以lxlO4 个/mL的密度接种制作细胞爬片，设定3个重复。 贴壁培养24 h后细胞经4%多聚甲醛固定，按照试 剂盒说明书进行TUNEL染色，再用H〇echst33258 染色液处理10 min对细胞核进行染色，PBS洗3次 后用抗荧光猝灭封片液进行封片，荧光显微镜下观 察并随机选取3个视野对凋亡细胞进行计数。1.2.7细胞分化诱导：成骨细胞分化诱导：细胞以

lxl〇4个/mL的密度接种6孔板，贴壁培养12 h后

更换培养液为成骨诱导液（DMEM高糖培养基含

中国骨质疏松杂志 2019 年 U 月第 25 卷第丨2 期 Chin J Ostcoporos，December 2019,Vol 25, No.121671

10% FBS、50 |xmol/L 抗坏血酸、丨0 mmol/L (3-鱗酸 甘油和0. 1 pmol/L地塞米松），连续培养21 d,每3 天更换一次成骨诱导液。脂肪细胞分化诱导：细胞 以lxl〇5个/mL的密度接种6孔板，贴壁培养12 h 后更换培养液成脂诱导液（DMEM高糖培养基含10

pg/mL 胰岛素、10% FBS, 0.5 mmoI/L3-异丁基-1-

扩大，骨髓脂肪组织增加（图1 A)。骨计量学参数 统计发现0P组小鼠骨小梁平均厚度（Tb.Th)、骨小 梁面积百分比（Tb.A)以及骨小梁数目均明显低于 生理盐水组对照（Tb.N),且差异有统计学意义（P<0.05)，见表1。说明成功建立骨质疏松小鼠模型。 分别从0P组及NC组小鼠的骨髓中分离MSCs进 行体外培养，3代后发现两组细胞均贴壁生长，呈长 梭形，且两组细胞形态无明显差异（图1B)。

NC group

OP group

甲基黄嘌呤JO (xmol/L地塞米松），连续培养8 d, 每3天更换一次诱导液。

1.2.8 Western blot:细胞收集后用含10% PMSF的

RIPA裂解液冰上裂解30 min,收集上清总蛋白。 BCA试剂盒测定蛋白浓度。各组取50 jxg蛋白进行

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-

PAGE)分离，转印至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白

(BSA)室温封闭1 h后，分别加入一抗：Runx2、

Osterix、C/EBPct、PPAR-y 以及内参 P-actin ( 1:

10 000稀释），4t：孵育过夜。次日洗膜3次后加入 二抗（丨：1〇〇〇〇稀释）室温孵育2 h,洗膜3次后采 用辣根过氧化物酶标记的增强性化学发光法显色，

X胶片感光。

1.2.9碱性磷酸酶（ALP)活性检测：ALP活性采用 试剂盒进行检测。消化收集成骨分化诱导7 d后的 细胞，裂解后收集上清。每组样品取50 jjlL加人96 孔板中，设定3个复孔，加人缓冲液及显色底物， 37 T显色反应30 min后终止反应，分光光度计上 405 nm波长处测定吸光度值，通过与对照组样品吸 光度的比值判断实验组样品ALP活性改变情况。 1.2. 10茜素红染色：细胞用70%的冰预冷乙醇固 定1 h，超纯水漂洗3次后以40 mmol/L茜素红染色 液染色15 min,漂洗后显微镜下观察。

1.2.11油红0染色：用加人3. 7%的中性甲醛固 定细胞10 min，0. 5%油红0染色1 h，70%乙醇漂洗 多余染色液后显微镜观察。1.3统计学处理

采用ImageJ 1.8.0软件进行图像定量分析，数 据以SPSS 17.0进行统计学分析，以表示，采用

Student’ sz检验比较组间差异。检验水准（a)

表1

两组小鼠骨计量学参数比较

图1 Fig. 1

两组小鼠骨组织形态及骨髓MSCs细胞形态

A:骨组织学形态；B:骨髓MSCs细胞形态。

Bone morphology and cell morphology of bone

marrow MSCs of mice in both groups

A ： Bone morphology； B ： Cell morphology of bone marrow MSCs.

Table 1 Comparison of bone histomorphometrical parameters of mice in both groups (无±s)

组别NC0P

BMD/(mg/cm'3 )326. 47±12. 48261.31±9. 57*

Tb.Th/mm0.061 ±0.0050. 048 ±0. 003 •

Tb.A/%48. 31 ±2. 6726. 14±1.79*

Tb.N/mm'16. 23±0. 594. 17±0. 22*

注：与NC组相比，•/><0. 05。

2.2 OP-MSCs的干细胞表面分化抗原表达水平

检测

两组小鼠MSCs传代4次后以流式细胞术鉴定 干细胞表面分化抗原的表达情况。结桌发现，NC-

MSCs细胞表面高表达干细胞表面阳性抗原CD44

为 0.05。

2结果

2.1骨质疏松小鼠模型建立及检测

0P组小鼠连续注射Dex 5周后，经检测发现 0P组小鼠BMD低于NC组（表丨）。分别取两组小 鼠股骨做骨组织切片，HE染色后观察发现与NC组 小鼠相比，0P组小鼠骨小梁数目减少，小梁间间隙

及Scarl,而阴性抗原CDllb及CD34表达量都很 低。OP-MSCs细胞表面分化抗原表达情况与CN-

BMSCs类似。见图2。

2.3 OP-BMSCs的增殖能力检测

采用CKK-8法检测OP-MSCs的增殖能力。结

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Isotype

Scar I

uoncuonc

-----MarkersCDllb

CD34

CD44

果显示，在贴壁后6~48 h的生长过程中，OP-MSCs 的活细胞数量明显低于NC-MSCs组，以吸光度值和 检测时间点绘制的增殖曲线显示OP-MSCs的增殖 活性降低，且差异具有统计学意义（图3)。2.4 OP-MSCs的凋亡水平检测

以脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末 端标记法（TUNEL)检测两组细胞的凋亡水平。荧 光显微镜下观察发现NC-MSCs组细胞凋亡数量较 少，而OP-MSCs组细胞凋亡水平与NC-MSCs类似。 统计发现两组细胞凋亡数量差异并无统计学意义。 见图4。

2.5 OP-MSCs的多向分化能力检测

对两组细胞分别进行成骨和成脂肪分化诱导。 结果显示，在成骨分化诱导7 d后，OP-MSCs细胞内 碱性磷酸酶（ALP)活性低于NC-MSCs(图5A)。在

图3

SUSWONsosw.do

10° 10’ 10J 10* to4 10° l。’ 103 10* 104 10° »〇' 10j I#3

10

* 10® 1«' 10* ，0*

图2 NC-MSCs及OP-MSCs细胞表面分化抗原

Fig.2 Cell surface markers of NC- and OP-MSCs detected

NC-MSCs及OP-MSCs的细胞增殖能力（与NC-

MSCs 组相比，• P<0. 05, P<0. 01)

Fig.3 Cell proliferation rate of both NC- and OP-MSCs ( vs NC-MSCs, * P<0. 05

P<0. 01)

Sui—

UN

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H■

^ ^ w ^ & 4 2 w

Q.odw118JO%/lfso 售 3

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C-M

图4 NC-MSCs及OP-MSCs细胞凋亡水平

Fig.4 Cell apoptosis of NC- and OP-MSCs

中国骨质疏松杂志 20丨9年12月第25卷第丨2期 Chin J Oste叩oros, December 2019,Vol 25, No. 121673

成骨分化诱导21 d后，茜素红染色发现NC-MSCs 比NC-MSCs多（图5D)。定量分析发现两组细胞茜 形成大量矿化小结，说明已分化为成骨细胞，而0P-

素红染色和油红〇染色的差异均具有统计学意义MSCs矿化小结明显减少（图5B)。成脂肪分化诱导

（图5C、5E)。

过程中OP-MSCs更容易形成脂滴，油红0阳性细胞

NC-MSCs OP-MSCs

NC-MSCs

OP-MSCs

L2Mu(

lu0of1olUieJJJ1I0-. SU8 P

8- iUl0.<4Jss0. JU L>>.20.6SJBZIIV

0.0I P(IOJJUOUJ3>0PO..8JU 0.P

OO..6 1O

4JO..41J)

O..20

).20..0

C

.0

图S两组细胞成骨分化及脂肪分化能力比较「P<0. 05 , \" P<0. 01，…P<0. 001)

Fig.5 Osteoblastic and adipocytic differentiation properties of both MSC groups (• P<0. 05

P<0. 01，…P<0. 001)

2.6 OP-MSCs中成骨细胞及脂肪细胞转录因子的 性的改变。

表达水平

本研究首先以过量糖皮质激素来诱发小鼠的骨 MSCs分化为不同的细胞系由相关转录因子驱

质疏松病理表型。各种骨组织计量学参数检测统计 动。因此本研究在诱导两组MSCs向成骨细胞及脂 的结果证明模型建立成功。分离培养的0P组

肪细胞分化的过程中以Western blot分别检测相关 MSCs在形态上与正常的NC组小鼠MSCs并无明显

转录因子的表达水平。结果显示，在成骨分化过程 差异。进一步对比两组细胞表面分化抗原的表达情 中成骨细胞转录因子Osterix及Runx2在NC-MSCs 况，发现对于被测抗原两组MSCs表达类似，而且表 均呈现高表达状态，但在OP-MSCs中的表达量却很 达水平也无明显差异。这些结果说明两组厘5以具 低。而成脂肪分化过程，脂肪细胞转录因子ppar7 有相似的表型，而病理骨髓微环境并不会改变MSCs 及C/EBPc(在OP-MSCs中的表达水平均高于NC-

的表型。

MSCs,且表达差异均具有统计学意义。见图6。

增殖能力及分化潜能是干细胞的两大特性。有 3讨论

研究[12“3]证实来自骨质疏松患者的MSCs在体外增 殖能力下降。本研究也发现〇P-MSCs的增殖活性 从干细胞角度出发，促进患者自身骨髓MSCs

明显降低，在贴壁后6 h内其增殖的细胞数就显著 对骨组织进行修复被认为是临床上有效治疗骨质疏 低于正常的NC-MSCs。此后在检测的48 h内都保 松的方法之一[7~。然而骨质疏松患者骨髓微环境 持低水平增长。由于对增殖的检测采用的是CKK-8 被改变，炎症因子含量增高，氧化应激增加[1°]。在 实验，而CKK-8主要检测活细胞数量。因此0P-

此种病理微环境下MSCs的生物学活性极有可能受 MSCs组吸光度值低同样可能是由于凋亡细胞数增

到影响，从而抑制其向成骨细胞的分化以及对骨组 多导致。为验证此可能性，笔者进一步检测了两组 织的修复。前期研究[\"]发现来自骨质疏松模型动 细胞在体外培养过程中的凋亡水平。TUNEL实验 物的OP-MSCs在正常成骨环境中也难以分化为成 发现OP-MSCs的凋亡程度与NC-MSCs相似，并未 骨细胞，说明长期处于病理骨髓微环境下MSCS已 表现出凋亡水平增加。这些结果不仅证实CKK-8 发生改变。本研究通过检测隨㊀以表面分化抗原、 实验检测的结果是细胞增殖数目增加所致，即长期

细胞增殖、凋亡以及多向分化等多种生物学指标，以

处于病理微环境下MSCs增殖能力下降，而且说明

期系统探究长期处于病理微环境下MSCs生物学特

此病理微环境中的MSCs在体外正常培养中并不会

中国骨质疏松杂志 2019 年 12 月第 25 卷第 12 期 Chin J Osteoporos，December 2019,Vol 25, No. 12

NC-MSCs

Osterix

uJqo3JSo3JXD0PV.2«fJU9J9£JP

OP-MSCs

Runx2

P-actin

3d

7d

14d

3d

7d

14d

U0I.219-U

IIUJ3SIP

(/)|«0)>1

发生细胞过度凋亡。

MSCs具有多向分化潜能，在适当诱导条件下能

分化为多种中胚层细胞表型。其中向成骨细胞及脂 肪细胞的分化过程中存在一种相互制约的平衡关 系[1415]。前期研究[8]发现在成骨环境下〇P-MSCS 仍然能分化为脂肪细胞，说明OP-MSCs的分化潜能 被改变。本研究进一步比较了 OP-MSCs与NC-

MSCs向成骨细胞及脂肪细胞的分化能力。结果发

现，在相同的诱导条件下，〇P-MSCS难以分化为成 骨细胞，却更易分化为脂肪细胞，说明长期处于骨质 疏松病理微环境下的MSCs表型虽未发生改变，但 分化潜能已与正常MSCs有所差别，而这可能是导 致骨质疏松症的原因之一。

MSCs向子代细胞的分化是由少数几个转录因

子驱动相关基因表达而启动的[16_18]。Western blot 结果证实成骨诱导过程中成骨细胞特异性转录因子

Runx2及Osterix在OP-MSCs中呈现持续低水平表

[3 ]

达。相反在成脂肪诱导早期OP-MSCs中就开始高 表达C/EBPa及PPAR7。这些转录因子异常表达 极有可能是OP-MSCs分化潜能改变的原因。而其

UOJSSWJdxl^sloJCJlo

3d 图6

7d 14d 3d 7d 14d 2d 4d 8d 2d 4d 8d

Treatment time Treatment time Treatment time Treatment time

两组细胞成骨分化及脂肪分化中转录因子表达水平r P<〇. 05, \" P<0. 01，…P<0. 001)

Fig.6 The expression levels of transcription factors during osteoblastic and adipocytic differentiation of both MSC groups(* P<0. 05, ** P<0. 01 , *** P<0. 001)

中的分子机制仍有待更深人的研究。

综上，本研究发现长期处于病理微环境下MSCs 的形态及表面分化抗原并未发生改变，即仍具有

MSCs正常表型。但其增殖能力及多向分化潜能都

与正常MSCs有明显差异。本研究结果说明骨质疏 松病理骨髓微环境对患者MSCs生物学特性有一定 的影响，在临床上通过促进自身MSCs增殖并分化 为成骨细胞来修复骨组织时应考虑到病理微环境的 影响以及MSCs生物学特性的改变。

【参

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(收稿日期：2018-10-23;修回日期：2019-01-07)