第３３卷第２期２０１２年４月暨南大学学报（医学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄｉｃｉｎｅＶ０１．３３Ｎｏ．２Ｅｄｉｔｉｏｎ）＆ｏｒ．２０１２４００例地中海贫血基因检测分析李莉，林晓丹，陈文璨（暨南大学附属第一医院临床医学检验中心，广东广州５１０６３０）［摘要】目的：应用基因诊断技术对４００例病人进行地中海贫血（简称地贫）基因检测，了解其基因突变的类型，旨在为临床预防地贫萤症患儿的出生提供指导。方法：４００个样本分别检测Ｏｔ一地贫及Ｂ一地贫基因型，Ⅸ一地贫采用ｇａｐ—ＰＣＲ技术检测东南亚型缺失（一一”‘）、右侧缺失（一ａ”）和左侧缺失（一ａ４２），母一地贫采用聚合酶链反应（ＰｃＲ）一膜反向点杂交技术（ＲＤＢ）检测Ｂ一珠蛋向基因上的１７个位点突变。结果：在进行地贫基因检查的４００例病人中，检出ａ一珠蛋白基因缺失的有１１８例．检出１３一珠蛋白基因突变者共７８例，均为杂合子，检出ｑＢ复合型地贫者６例．检出Ｂａｎｓ水肿胎儿１例。结论：基因诊断技术能确诊地贫缺失或突变，检测绒毛、羊水或脐带血时须避免母体血污染。［关键词】地中海贫血；基因诊断；产前诊断【中图分类号］Ｒ３３［文献标志码］Ｂ【文章编号】１０００—９９６５１２０１２）０２—０２０９—０４Ｇｅｎｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ４００ｃａｓｅｓｏｆｔｈａｌａｓｓｅｍｉａＬＩＬｉ，ＬＩＮＸｉａｏ—ｄａｎ，ＣＨＥＮＷｅｎ－ｊｉｎｇ（ＣｅｎｔｅｒｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ａｉｍ：Ｐｅｒｆｏｒｍｇｅｎｅｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅａｏｎ４００ｓｐｅｃｉｍｅｎ，ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄｓｅｖｅｒｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓｏｆｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｉｎＧｕａｎｇｄｏｎｇａｎｄｃｅｎｔｒｅｌｔｈｅｂｉｒｔｈｂｆｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｍｅｔｈ－ｏｔｉｓ：Ｔｈｅｔｏｍｍｏｎｅｓｔｋｎｏｗｎ３ｋｉｎｄｓｏｆｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｔｙｐｅｓｏｆｎ．ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ（一一５８‘／一ａ３＋’／一８‘２）ｗｅｒｅｏｎｃｈｅｃｋｅｄｂｙｇａｐ—ＰＣＲ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｔｈｅｓｐｅｃｉｍｅｎｗｅｒｅｗｅｒｅｃｏｍｍｏｎｅｓｔｋｎｏｗｎ１７ｔｙｐｅｓｍｕｔａｔｉｏｎ１３－ｇｌｏｂｉｎｇｅｎｅｏｆｔｈｅ４００ｉｄｅｎｆｉｆｉｅｄｂｙｒｅｖｅｌ＂￥ｅｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＲＤＢ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ：１１８ａｓｃａｓｅｓｏｆｔｈｅ４００ｓｐｅｃｉｍｅｎＣＳ．．ｓｅｓｄｅｔｅｃｔｅｄａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａａｎｄ７８ｃａｓｅｃａｓｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｓａｓ，８一ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）．６ｗｅｒｅｄ－ａｎｄ１３－ｃｏｍｐｌｅｘｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．１ｎｏｓｉｓｉｓ８１１ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄＢａｒｔ’Ｓｈｙｄｎ】ｐｓｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉａｇ—ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏａｖｏｉｄｃｏｎｔａｍｉｎａ・ｔｉｏｎｓｆｒｏｍｍａｔｅｒｎａｌｂｌｏｏｄｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｉｌｌｉ．ａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄａｎｄｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ地中海贫血（以下简称“地贫”）是一种危害极大的常染色体隐性遗传的血红蛋白疾病，主要为小地贫和３－地贫，其发病机制是ｄ－及０－珠蛋白基因的先天性缺陷，造成ｏ【一及Ｂ一珠蛋白肽链合成减少或缺失，从而引起血红蛋白生成障碍，导致无效造血和溶血性贫血。它广泛分布于全球地中海各地，我国广东、广西、海南等省为高发区。重型ｎ－地贫胎儿（Ｂａｒｔｓ水肿），多在妊娠末期胎死腹中或产下即死。而血红蛋白Ｈ病（ＨｂＨ病）及重型Ｂ－地贫患儿一般在出生后４～６个月发病，呈进行性贫血。要靠输血［收稿日期】２０１１—１０—１９【基金项目】广东省医学科研基金项目（Ａ２００８３４１）。【作者简介】李莉（１９８２一），女．技师．顼士，研究方向：临床检验诊断学万方数据暨南大学学报（医学版）第３３卷维持生命，并易发多种合并症，多于童年或青少年期死亡，给家庭和社会带来沉重负担。因此，在地贫高发区对夫妇双方均为地贫基因携带者的孕妇，在妊娠早期筛查或中期进行产前诊断，防止重型地贫儿出生，是最有效的预防措施。为此。本研究对疑似地贫的４００名患者进行了ａ－和Ｂ一地贫的基因诊断，既检测外周血，又检测绒毛、羊水及脐带血，且提出避免母体血污染的方法．其结果对产前诊断产生重要的指导作用，现将结果报告如下。１材料及方法（１）对象从２００９年１１月２４Ｅｌ至２０１０年１１月２４日在暨南大学附属第一医院临床医学检验中心进行地贫基因检查的病人４００例，年龄主要为０—４０岁，其中男１２０例，女２６４例，特殊标本（绒毛、羊水及脐血）１６例。（２）样本采集和处理使用基因诊断的真空采血管，如成人用柠檬酸钠或乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）抗凝全血提取ＤＮＡ，不可用肝素抗凝全血，及时送检或置２～８℃冰箱中并于５ｄ内检测，或在一２０℃存放１个月以内检测。胎儿地贫基因检查的标本，可以在妊娠７～９周取绒毛，或妊娠１６～２４周抽取羊水，或者在妊娠大于２０周取脐带血，提取ＤＮＡ进行检查。（３）设备及检测试剂主要设备有美国ＡＢＩ７０００荧光定量扩增仪，美国ＢＩＯ－ＲＡＤ电泳仪（Ｐｏｗ—ｅｒＰａｃＢａｓｉｃ１６４－５０５０）及电泳槽，美国ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ凝胶成像系统及美国ＳＨＥＬＬＡＢ分子杂交仪。地中海贫血检测试剂盒购自深圳益生堂生物企业有限公司，琼脂糖来自ＢｌＯＷＥＳＴ公司。（４）方法分为检测缺失型ａ一地贫和突变型Ｂ．地贫基因型的方法。ｄ一地贫采用跨越断裂点的ＰＣＲ技术（也称裂口ＰＣＲ，ｇａｐ．ＰＣＲ）检测东南亚型缺失（一一５“）、右侧缺失（一一７）和左侧缺失（一ａ４２）。１３一地贫采用ＰＣＲ一膜反向点杂交技术（ＲＤＢ）检测１７种基因位点突变，分别是ＣＤ４１－４２、ＩＶＳ－２－６５４、－２８、ＣＤ７ｌｆ７２、ＣＤｌ７、１３Ｅ、ＣＤ３Ｉ、ＣＤ２７／２８、ＩＶＳＩ一１、ＣＩ）４３、．３２、－２９、－３０、ＣＤｌ４．１５、ＣＡＰ、Ｉｎｔ、ＩＶＳｌ－５。采集的标本可以是血液、绒毛、羊水和脐带血。标本ＤＮＡ的提取严格按照试剂盒说鹎书操作。ｅｓ一地贫基因检测取前面采集的ＤＮＡ样品溶液４ｐＬ，加入ＰＣＲ反应管中，９４℃变性１５ｒａｉｎ后，９８℃４５ｓ，６４℃７５ｓ，７２℃ｌｇＯｓｔａｉｎ。共３５个循环，７２℃延伸５ｒａｉｎ，一２０℃保存或立即电泳。取ＰＣＲ产物ｌＯ“Ｌ加２ＩＬＬ上样万方数据缓冲液，于１．Ｏ％琼脂糖凝胶上进行电泳６０ｒａｉｎ，移置凝胶成像系统进行结果分析并记录。根据扩增产物长度得出诊断结果。电泳结果的判定：２．０、ｌ－８、１．６和１．３ｋｂ扩增带分别对应于ａ一珠蛋白基因右俱Ｉ｜缺失（一ａ３７）、无缺失、左侧缺失（一ａ４’２）及东南亚型缺失（一一““）。Ｂ一地贫基因检测取前面采集的ＤＮＡ样品溶液２灿，加入ＰＣＲ反应管中，９４℃变性５ｒａｉｎ后，舛℃６０ｓ，５５℃３０Ｓ，７２℃６０ｓｒｎｉｎ，共３５个循环，７２℃延伸５ｍｉｎ，一２０℃保存或当天检测。ＰＣＲ产物与试剂盒配置的含探针的膜条置于４３℃杂交仅进行反向点杂交过夜，次日取出进行洗膜和显色。根据膜上ｍ现的蓝色斑点，判断Ｂ一珠蛋白基因相应位点是否有突变，及判断突变为杂合子或纯合子。２结果在进行地贫基因检查的４００例病人中，检测到有基因改变（仅．或１３．地贫）的达到１９０例，占总检测对象的４７．５０％。（１）ｄ．地贫基因检测结果４００例检测对象中，检测出Ｏ／．一珠蛋白基因缺失的有１１８例，占总检测对象的２９．５０％。其中一一驱“／ａａ８９例，一ａ１７／ａａ１５例，一ａ４－２／８．ａ７例，一一“／一ａ３‘７有５例，一一“‘／一ａ４２１例，一一５Ｅ‘／一一５队１例。东南亚型缺失（一一５Ｅ“）、右侧缺失（一ａ３７）和左侧缺失（一ａ４・２）３种缺失共１１１例，占ａ一地贫阳性对象的９４．０７％。仅一地贫基因检测结果见表１。表ｌ４００例行珠蛋白基因缺失检测结果（２）１３－地贫基因检测结果４００个检测对象中检出Ｂ一珠蛋白基因突变类型９种，共７８例，均为杂合子，占总检测对象的１９．５０％。其中ＣＤ４１－４２位突变３５例，ＩＶＳ－２－６５４位突变１６例，ＣＤｌ７位突变８例，－２８位突变８例，ＢＥ位突变５例，ＣＤ２７／２８位突变３例，ＣＤ７１－７２位突变ｌ例，ＩＶＳＩ一１位突变ｌ例，ＩＶＳＩ－５位突变ｌ例。Ｂ－地贫基因诊断结果见表２。第２期李莉，等：４００例地中海贫血基阏检测分析２ｌｌ表２中列出的前５种突变类型是中国人常见的类及４个基因都累及的重型位一地贫（Ｂａｒｔｓ水肿，型，共６８例。占总１３－地贫阳性者的８７．１８％。一一／一一）［１１。Ｂ一地贫是由于第１１号染色体短裹２４００例争珠蛋白基因突变检测结果臂１３一珠蛋白基因缺陷所致，绝大多数是由于基因发生了点突变，少数是因为基因发生了缺失。目前对地贫的治疗尚无好的办法。因此对本病重在预防，而应用基因检测技术进行产前诊断则可以预防重症地贫儿的出生。检测地贫的方法包括地贫的初筛和基因的确诊，前者主要有血液学指标如血红蛋白含量（ＨＧＢ）、平均红细胞体积（ＭＣＶ）、平均红细胞血红蛋白含量（ＭＣＨ）及红细胞分布宽度（ＲＤＷ）等。结合血红蛋白电泳分析可初步诊断地中海贫血¨。４Ｊ，后者则要依靠地贫的分子生物学诊断。本研究中，在进行地贫基因检查的４００例病人中，地中海贫血总发生率达到４７．５０％。检出ａＢ复合型地中海贫（３）ａＢ复合型地中海贫血检测结果检出者６血者６例，占总检测对象的１．５％。例，占总检测对象的１．５％，数据已并入表１及表２ｄ．地贫采用ｇａｐ—ＰＣＲ技术检测中国人最常见的中。分别为：一一８队／ａａ合并［３Ｅ／Ｎ２例，—一驱‘／ａａ３种缺失类型，检出Ｏｒ．・地贫阳性者１１８例，占合并ＣＤ４１—４２／Ｎ１例，一一“‘／ａｎ合并一２８／Ｎｌ２９．５０％。其中阳性率最高的前３种东南亚型缺失例，一ａａ．２／ａａ合并ＩＶＳ一２—６５４／Ｎ１例，一ａ４２／ａａ合（一一距‘）、右侧缺失（一ａ３・７）和左侧缺失（一ａ４２）共并ＣＤ４１－４２／Ｎ１例。１１１例，占总ｄ一地贫阳性对象的９４．０７％。仅东南（４）特殊样本地贫基因检测结果４００例检测亚缺失型（—一““）就８９例（２２．２５％），提示本地区对象中绒毛标本２例，羊水标本１０例，脐血标本４的ａ一地贫基因型主要以东南亚缺失型为主，与同例，检测到有基因改变（仅一或Ｂ．地贫）的有８例，在类研究结果吻合口。６Ｊ。检出ＨｂＨ病者６例，包括５这三种标本中地贫检出率占５０％，详见表３。例一一５队／一ａ３。７和１例一一５Ｅ‘／一ａ４一，均为成人外周血标本。有东南亚缺失（标准型）受检者的配偶表３１６例特殊样本地中海贫血基因检测结果最好也进行地贫的血液学筛查，如果配偶基因也有东南亚缺失，就有可能出现子代的ＨｂＨ病或Ｂａｒｔｓ水肿。Ｂ－地贫采用ＰＣＲ．膜反向点杂交技术检测１７种基因位点突变，本研究中检出Ｂ一地贫阳性者７８例，占总研究对象的．１９．５０％。其中表２中前面５种突变类型（ＣＤ４１－４２、ＩＶＳ－２－６５４、ＣＤｌ７、－２８和ＣＤ７１－７２）３讨论是中国人常见的类型，共６８例，占总Ｂ－地贫阳性者的８７．１８％。共检出９种基因突变类型，以ＣＤ４１－４２地中海贫血是我国南方最常见和危害最大的突变频率最高（８．７５％），其次是ＩＶＳ－２－６５４遗传病之一。仅一地贫是由于第１６号染色体短臂末（４．００％），ＣＤｌ７（２．００％）和一２８（２．００％）次之，与端ａ．珠蛋白基因缺陷所致，有缺失型和非缺失型广东地区同类研究结果基本吻合№。Ｊ，但阳性率顺两种，缺失型是我国主要类型，而东南亚型缺失序与广西地区的报道［８１稍有不同。据邓国生等哺１（一一疆“）、右侧缺失（一ａ３。７）和左侧缺失（一ａ４２）是的报道，以ＣＤ４１４２突变频率最高，这点与本研究中国人最常见的仪，地贫缺失类型。ａ－地贫根据受相同，但其余依次为ＣＤｌ７，ＩＶＳ－２－６５４，－２８．ＣＤ＇／Ｉ．７２。累的基因可以分为４种，累及一个基因的静止型本研究检测的１７基因型覆盖了我国突变类型的（一ａ／ｃ￡ａ），累及２个基因的轻型（一一／ａａ或一∥９５％以上一】，开展这１７种地中海贫血突变基因的产一ｄ），累及３个基因的中间型（ＨｂＨ病，一一／一ｄ）前诊断，能防止绝大多数重度Ｂ一地中海贫血患儿的万方数据２１２暨南大学学报（医学版＞第３３卷出生，具有重要的优生优育的意义。产前基因诊断孕早期可取绒毛进行基因检测，孕中期或晚期可在Ｂ超引导下行羊膜腔穿刺和经腹脐静脉穿刺术抽取羊水及脐带血进行诊断。绒毛、羊水和脐带血３种样本直接检测的是胎儿的基因型，对产前诊断的意义尤为重大。这３类标本中，目前用于地中海贫血产前诊断的主要为羊水细胞¨…，因为早期取绒毛及中晚期抽脐血都较易受母体细胞污染，且操作技术要求较高，对胎儿有一定的影响¨“。本研究中这３种样本共１６例，检出地贫基因改变者有８例，占５０％，检出率比同类研究稍低¨“。其中有１例病人因Ｂ超发现胎儿水肿、大胎盘而进行地贫基因检测，脐血样本检出基因型为一一“／一一“‘：确诊为Ｂａｒｔｓ水肿胎儿，进行了引产。此病例此前曾有过生出Ｂａｒｔｓ水肿胎儿史，生出后不久死亡。像这种夫妻双方都有地贫基因改变的更应该重视产前诊断，避免地贫重症胎儿的出生。造成家庭和社会的极大负担。值得注意的是，若这３种样本在采集的过程中混入了母体的血液或母体的其他细胞成分，如果胎儿跟母体的基因型不同的话，检测结果可能就会受到干扰而致使误诊或漏诊。取羊水标本时，废弃掉先抽出的２ｍＬ可以在一定程度上避免避免母体血的污染。而有条件的医院则可以采用羊水细胞原位培养法，培养时胎儿羊水细胞贴壁生长，而母体血细胞悬浮，因此可最大限度地避免因母体血污染而导致的误诊，或因羊水细胞过少而导致的检测失败。［参考文献］［１］ＫＯＨＮＥＥ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄｔｒｅａｌｍｅｎｔ［Ｊ］，ＤｔｓｃｈＡｒｚｔｅｂｌＩｎｔ，２０１ｌ，１０８（３１／３２）：５３２—５４０．［２］王晓忠，曾学辉，占葆娥．ＭＣＶ和ＲＢＣ脆性及血红蛋万方数据白电泳在产前筛查地中海贫血的价值［Ｊ］．中国实验诊断学，２００９，１３（６）：７６１—７６３，［３］李彬，彭常军．Ｂ一地中海贫血的基因分布及其血常规参数变异分析［Ｊ］．临床血液学杂志，２００９，２２（４）：１８３—１８４，［４］王耕。王琳．平均红细胞体积和平均红细胞血红蛋白含量筛查妊娠合并轻型地中海贫血的价值［Ｊ］．中国优生与遗传杂志，２０１Ｉ．１９（４）：６５—６６．［５］陈亚军，陈堵院，夏玉英，等．用ｇａｐ－ＰＣＲ筛查ｑ一珠蛋白合成障碍性贫血基因携带者的评价［Ｊ］．临床检验杂志，２００６，２４（４）：２５９—２６１．［６］田文芳，唐喜军．易素芬．广东省珠海地区ａ一和Ｂ－地中海贫血基因突变类型研究［Ｊ］．检验医学与临床，２０１ｌ，８（１２）：１４８７—１４８８．［７］华亮，李婉玲，朱冰．等．５０４２例地中海贫血高风险儿童Ｂ一地中海贫血基因分析［Ｊ］．中国小儿血液与肿瘤杂志，２０１Ｉ，１６（３）：１２５一１２８．【８］邓国生，罗宇迪，张宁，玉林地区地中海贫血基因缺失和点突变分布的探讨［Ｊ］．中华全科医学，２０１ｌ，９（１）：１２２—１２３．［９］陆国辉，徐湘民．临床遗传咨询【Ｍ］．北京：北京大学医学出版社，２００７：２４０—２４４．［１０］卢秋维，李东明．６９７例羊水细胞ｑ－地中海贫血的基因检测［Ｊ］．山东医药．２０１０，５０（３２）；９３—９４．［１１］ＬＩＡＯＣ，ＭＯＱＨ，ＬＩＪ，ｅｔａ１．Ｃａｒｒｉｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒａｌ・ｐｈａ－ａｎｄｂｅｔａ・ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｉｎｐｒｅｇｎａｎｃｙ：ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｌｌ１ｌ－ｙｅａｒｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｐｒｏｇｒａｍｉｎＧｕａｎｇｚｈｏｕＭａｔｅｒｎａｌａｎｄＮｅｏｎａｔａｌｈｏｓｐｉｔａｌ［Ｊ］．ＰｒｅｎａｔＤｉａｇｎ，２００５，２５（２）：１６３—１７１．【１２］郭晓玲，钟进，宋春林，等．孕期羊水及脐血地中海贫血的产前基因诊断［Ｊ］．中国妇幼保健，２０１１，２６（１３）：２０４０—２０４２．［责任编辑：陈咪梅］
