RNA凝胶电泳步骤及注意事项

步骤及注意事项

1%的RNA琼脂糖凝胶电泳可以用来检测RNA的完整性，本实验的主要目的是熟悉植物总RNA非变性胶电泳操作

原理和操作方法与步骤。

???一、实验目的

掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 ???二、实验原理

???RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 ???三、实验材料、器具及药品

???蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。 ???四、实验步骤

???(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

???(2)在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl1×TAE电泳缓冲液及1μl的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

???(3)打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。 ???试剂：

???(1)MOPS缓冲液(10*):0.4mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS)(Ph7.0)，0.1mol/LNaAc,10mol/LEDTA。 ???(2)上样染料：50%甘油，1mmol/LEDTA,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 ???(3)甲醛。

???(4)去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。 ???操作：

???(1)将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 ???(2)配制琼脂糖凝胶。

???①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 ???②待胶凉至60--70℃，依次向其中加入9ml甲醛、5ml10XMOPS缓冲液和0.5ul溴化乙锭，混合均匀。 ???③灌制琼脂糖凝胶。 ???(3)样品准备：

???①取DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂：10xMOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺(去离子)10ul，RNA样品4.5ul,混匀。

???②将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 ???③向管中加入3ul上样染料，混匀。 ???(4)上样。

???(5)电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml的电压下电泳。 ???(6)电泳结束后，在紫外灯下检查结果。

???小结：RNA琼脂糖凝胶电泳中务必去除RNASE酶的污染，所有的试剂需用DEPC水配制，所用的器材也要的DEPC处理并灭菌，防止RNA被降解