几种常见的细小病毒病毒样颗粒研究进展

中国兽医杂志　2019年(第55卷)第2期

ChineseJournalofVeterinaryMedicine

几种常见的细小病毒病毒样颗粒研究进展

董　浩,姜　萌,杨一鸣,波,张文慧

中图分类号:S852.65+9.2　　　　　文献标志码:A　　　　　文章编号:05296005(2019)02008403

(吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118)

　　致病性细小病毒大多为单股DNA病毒[1],分类地位主要集中在细小病毒科,按国际病毒分类委员

体。另外,VLPs可通过交联B细胞膜表面免疫球蛋白从而诱导B细胞反应,还可有效刺激CD4+T细会(ICTV)编写的分类报告,根据各种细小病毒侵染的宿主不同,可将细小病毒科分为两个亚科,分别是侵染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和侵染昆虫等节肢动物的浓核病毒亚科(Densoviri-nae)[2]病毒均具有很强的破坏力。近年来流行较为严重的犬,传统疫苗的控制较为有、猪和鹅等细小限,加大新型疫苗的研制刻不容缓。

病毒样颗粒(VLPs)是一种不含有病原核酸,只通过病毒的一个或多个结构蛋白组成的空心颗粒[3]相似,。可以通过感染模式把抗原递呈给免疫细胞其不能进行自我复制,只是在形态上与病毒,

有效的诱导机体的免疫系统发挥免疫功能,产生保护作用。目前活病毒疫苗的主要不足就是安全性不能完全保证,因此对于传染病的防护VLPs有着传统疫苗不可比拟的优势。1　VLPs的结构及免疫机制

形成的具有一定规则VLPs是通过病毒的(通常为二十面体或杆状1个或多个结构蛋白装配)的超分子结构,直径在25nm~100nm之间。病毒的结构蛋白与包膜的结构特征决定了VLPs的免疫原性和抗原性。VLPs的特点是可以多层重复且高密度的把病原相关分子模式(PAMPs)展现出来,可以通过PAMPs激活固有免疫反应,被宿主细胞中的各种识别受体所识别,随后刺激巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞进行抗原捕获ⅡVLPs类分子,激活一系列的免疫应答,最后递呈给MHC通过交叉递呈的方式通过仍保留与原始病毒相近的受体结合位点。一些外源性MHCⅠ类途径进行递呈,可以,

使CD8+性免疫反应T细胞活化,这样可以更容易清除细胞内的病原

,实现CD8+T细胞介导的保护收稿日期:20170925

基金项目:国家重点研发计划(2016YFD0501002)

作者简介:董浩(1979),男,副教授,博士,研究方向为动物病毒学,E-mail:donghao_jlau@163.com

VLPs胞的增殖和细胞毒性T细胞反应。在某些情况下,

赖性IgM可以直接激活反应。因此B,细胞受体和刺激只需要低剂量的TVLPs细胞非依就可以使免疫系统激活保护反应,从而显著的降低了疫苗的成本[4]核酸,从而消除了活病毒重现的风险。在疫苗安全方面,VLPs不含有病毒的,不会造成具有活力的病毒传播,疫苗也不存在毒力返祖、产生免疫缺陷等风险。VLPs除了疫苗功能以外,还可以作为一种抗原递呈载体,不同种的病毒结构基因通过基(VLPs),因工程手段整合到一起形成病毒样颗溶性抗原可以有效提高可溶性抗原的免疫原性单个VLPs上嵌合多个免疫原性较低的可粒。还可以,分别表达外源抗原和VLPs,然后通过化学方法以共价或非共价的方式将其偶联至VLPs表面,也可以设计外源抗原的结合位点,这些抗原包括环肽、短肽等蛋白抗原以及半抗原、多糖等非蛋白抗原[5]。2　细小病毒VLPs的研究现状

目前,国内外主要集中在以下细小病毒的VLPs研究:犬细小病毒(CPV)、猪细小病毒(PPV)、人细小2.病毒B19(B19)、鹅细小病毒(GPV)等病毒的研究。是细小病毒科细小病毒属成员1　犬细小病毒VLPs的研究进展,具有细小病毒属病　犬细小病毒毒典型形态和结构[6]肠炎和急性心肌炎,发病率和病死率高。CPV可引起犬急性出血性,对犬及狐等经济动物具有极大的危害。CPV是一类结构简单的线状单链DNA病毒,形态呈六角形或圆形,等轴对称的二十面体,直径约为20nm,衣壳蛋白无囊膜,不含脂质或糖类[7]VP2CPVVLPs的制备。

通常是利用病毒结要分为真核表达体系和原核表达体系表达后组装而获得的。目前常用的表达体系主构蛋白,真核包含昆虫细胞表达系统和酵母表达系统,而原核主要是大肠杆菌表达系统。目前比较成熟的CPVVLPs利用真核表达系统的为多,主要原因是真核系统有利于实现外源蛋白翻译后的修饰和折叠,表达的重组ChineseJournalofVeterinaryMedicine

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VP2结构蛋白具有天然的分子构象,利于VLPs的表达系统表达,并在昆虫细胞和蛹中组装成病毒样

种猪中诱发高血清抗体滴度。再有,PPVVLPs可以与外源抗原嵌合,为开发预防和控制猪病的多联苗提供了可能,陈杨[15]等采用脂质体介导法将PPVVP2与猪伪狂犬病病毒DNA共转染Vero细胞,重组病毒PRVSA215/VP2株,电镜观察表明,感染的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV两种类病毒样颗粒,成功实现了利用PRV载体表达PPVVP2蛋2.3　人细小病毒B19VLPs的研究进展　人细小病白病毒样颗粒。

形成。Feng[8]等利用CPV的VP2蛋白在杆状病毒颗粒。VLPs的电子显微照片显示,与野生型细小病毒相比,它们的大小和形态非常相似。同时,该学者又在小鼠和狗中研究了VLPs的免疫原性,结果表明,CPV-VLPs刺激细胞和体液免疫应答。Xu[9]等利用小泛素样修饰(SUMO)融合模序在大肠杆菌中表达CPV的整体天然VP2蛋白,在融合模序切割后,CPVVP2蛋白自组装成VLPs,获得的VLPs具有类似真实病毒衣壳的大小和形状。免疫试验结果表明,VLPs可以有效地诱导抗CPV特异性抗体和淋巴细胞增殖。另外,也有学者利用CPVVLPs作为生物载体来应用,王斌

[10]

利用PCR的方法将犬

细小病毒的衣壳蛋白VP2基因扩增链接到pSMK载体质粒上VP2环境下蛋白,以,然后自组装成病毒样颗粒特性,利用大肠杆菌表达系统得到可溶性的VLP为原料将MPA修饰后的。量在体外MPA-QDs子点

生物VLPs-QD。

相容包裹进入病毒样颗粒内部性,且无生物毒性的荧,光形成具有良好复合物CPV2.所致的繁殖障碍是世界养猪业面临的问题2　猪细小病毒VLPs的研究进展　猪细小病毒,一旦病毒侵入易感猪群,发病率非常之高。PPV是单股负链nm,DNA轴对称由60病[11]个衣壳蛋白亚基组成毒,无囊膜,病毒粒。PPV基因组大小约,子结构呈二十面体等大小22nm~25120bp~200bp的回文结构[12]。

5.0kb,末端约有

蛋白入手PPV的,常用的表达体系主要包含酵母表达体VLPs制备也主要从结构基因VP2表达

系,比如Tamosiunas

[13]

等使用来自猪血清的病毒核

酸提取物扩增编码PPV主要衣壳蛋白VP2的基因,并将其插入到酿酒酵母表达质粒中,重组PPVVP2蛋白在酵母中有效表达,纯化后的PPVVP2蛋白的电子显微镜分析显示病毒样颗粒(VLP)自组装。产生针(MAb)。对重通过组PPVPPVVP2感染细胞的免疫荧光分析证实

蛋白的9种单克隆抗体了新产生的MAb的特异性。利用间接ELISA进行评估,结果表明,具有很高的灵敏度和特异度。另外也有通过杆状病毒-昆虫细胞表达体系进行组装的,Antonis[14]等用杆状病毒表达载体系统(BEVS)产生的由重组病毒样颗粒(PPV-VLP)组成的针对猪细小病毒(PPV)的新型疫苗,测试其免疫原性和保护效力PPV-VLP,的制剂在用作参考模型的豚鼠和目标物结果表明,在矿物油佐剂中的亚微量的毒B19颗粒直径为23nm,无囊膜包裹,病毒基因组是由3500个碱基组成的单链DNA,B19病毒在分子生物学上有独特性,末端回文序列长达365个碱基,G、C含量高,使得B19病毒二级结构牢固,而不易克隆入细菌中。B19病毒同其他小DNA病毒一样有种属特异性。有两种壳蛋白:VP1(83kDa)和VP2(58与抗体结合kDa),VP2。

占优势,VP1位于壳体外部,易成,也可以在原核表达体系中完成B19病毒的组装既可以在真核表达体系中完。邹小辉[16]等采用昆虫杆状病毒表达系统,成功制备了人细小病毒B19的VLPs。病毒样颗粒Sanchez-Rodriguez,在透射电镜下可见直径约[17]等报道了在大肠杆22nm菌中表达的重组VP2蛋白的B19VLP的体外自组装以及pH值和离子强度对组装过程的影响,研究结果表明pH值下,,VP2均匀的能够在体外完全形成VLPs在酸性和碱性pHVLP。值下组装在中性离子强度低,主要组件是小型中间体。体外自组装,

的VLPs在37℃下是高度稳定的,并且在80℃下30来作为异源分钟后,大部分颗粒保持组装DNA的载体,在药物和其他生物分子医。B19病毒也被用学成像中有着很大的应用前景,Sanchez-Rodrigu-ez[18]等将不同大小的异源线性dsDNA片段封装到B19共孵育V-VP2,并通过一次透析步骤进行装配过程VLP中的,其中将DNA和变性VP2,开启蛋白了使用这种VLP作为具有未来治疗应用传递系统的可能性。

2.GPV4　鹅细小病毒VLPs的研究进展毒,在分类学上属于细小病毒科直径20~22nm、无囊膜、二十面体对称的病　鹅细小病毒(Parvoviridae),细小病毒亚科(Parvovirinae),依赖病毒属(Dependovir-us)的成员,GPV基因组全长约为5.2kb,为单链、线性DNA。GPV基因组的一大特点是正负链DNA分子都具有回文序列。GPV总共编码3种结构蛋86

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[5]　罗尚星,申小强,顾文源,等.影响猪树突状细胞对猪细小病毒

508514.

白,分别是VP1、VP2和VP3。

Ju.H[19]等通过PCR扩增了GPVVP的基因,并使蛋白,电子显微镜显示在昆虫细胞中自发组装成VLPs,免疫实验也证明获得的VLPs具有较好的免疫原性。Chen.Z[20]等将野生型VP2密码子转化为在昆虫基因中更常见的密码子,使用杆状病毒表达GPV的VLPs的获得多采用真核表达体系。

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expressedinsilkwormpupaeself-assemblesintovirus-likeparticles

系统(BES)表达GPV的主要衣壳蛋白VP2组装成病毒样颗粒(VLP)。透射电镜结果显示VLP的形成,免疫原性测定结果显示,VLP是高度免疫原性的,引起高水平的中和抗体并提供针对致死性攻击的保护。3　

展望

细小病毒的VLPs主要由病毒的结构蛋白VP2自组装备成的不含遗传物质的空心颗粒DNA,能力,病毒无法复制和增殖因此安全性也是传统的活疫苗和弱毒苗所不,也就不具备感染致病的,由于没有能比拟的。另外由于VLPs可以出色的模拟病毒粒子的结构,与天然病毒具有相同的免疫原性,可以刺激机体产生持久的免疫反应。因此VLPs作为一种未来的新型疫苗是值得期待的。但目前在颗粒制备上也存在一些技术难题,不管是哪种表达体系,获得VLPs的过程就较繁琐,获得率又很低,这阻碍了病毒样颗粒疫苗向临床试验的转化,因此开发新型的表达体系,探索影响表达系统VLPs组装过程的影响因素,是目前最为重要的研究方向。此外,VLPs的生物载体特性也得到了很好的应用,通过化学偶联或者生物包被等方式把异源基因,药物,量子点及纳米颗粒等整合到VLPs上,为研究生物靶向治疗和生物纳米成像等方面提供材料。参考文献:

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