大脑能量代谢和神经传递动力学的NMR测定方法

王杰;;姜立红;徐富强

【摘 要】能量代谢和神经传递是生命的基石, 它们与所有神经性和精神性疾病都有互为因果的关系, 因此其研究对于脑功能的认识具有重要意义.正常情况下, 葡萄糖代谢是大脑能量的主要来源, 但定量描述大脑内糖类物质与神经传递动力学参数的研究方法是该领域内的一个瓶颈问题.核磁共振(NMR)方法以其特有的优势迅速成为该研究领域内的重要的研究工具.本文重点旨在对大脑中能量代谢和神经传递动力学进行研究的NMR技术、方法及其应用进行较详细的介绍. 【期刊名称】《波谱学杂志》 【年(卷),期】2010(027)003 【总页数】14页(P341-3)

【关键词】核磁共振(NMR);能量代谢;1H-[13C]-NMR;神经传递动力学;三羧酸循环

【作 者】王杰;;姜立红;徐富强

【作者单位】波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心,中国科学院,武汉物理与数学研究所,湖北,武汉,430071;波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心,中国科学院,武汉物理与数学研究所,湖北,武汉,430071;中国科学院,研究生院,北京,100049;美国耶鲁大学,医学院核磁共振研究中心,康涅狄格州,06511,美国;波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心,中国科学院,武汉物理与数学研究所,湖北,武汉,430071;武汉光电国家实验室,湖北,武汉,430074

【正文语种】中 文 【中图分类】O482.53 引言

能量代谢和神经传递是生命的基石， 其状态异常将导致神经性和精神性疾病[1,2]. 神经精神疾病， 例如阿尔茨海默氏症(老年痴呆症)、 帕金森氏症和亨廷顿氏病等， 给社会和人民生活带来了巨大的负担. 然而迄今为止， 仍然缺乏准确的预警、 早检和有效的治疗. 对大脑中的能量代谢和神经传递动力学的研究可能给这些疾病的预防及药物研发提供策略而具有重要的意义.

众所周知， 糖类代谢为大脑的最主要能源. 目前研究能量代谢的方法， 如正电子断层扫描(PET)[3-6]， 单光子发射型计算机断层显像[5]， 放射自显影[7,8]和核磁共振成像(MRI)[6, 9]等， 可以测量大脑内葡萄糖的初级代谢. 但是由于这些方法不能区分标记物以及标记物在复杂的代谢网络中产生的代谢中间产物[10]， 因此不能用于能量代谢和神经递质的动力学研究. 作为一种能够测定混合物成分的化学结构和浓度的分析技术， 磁共振波谱(Magnetic Resonance Spectroscopy， MRS)以其特有的优点[11,12]， 可以观测到13C标记能源物在各个代谢中间产物的浓度及富集信息. 13C是一个稳定同位素， 可以利用MRS方法检测, 但其自然丰度仅为1.1%(均分布在代谢物的各个物质), 导致该方法的灵敏度不高， 但拥有代谢动力学研究中其他方法不可取代的优点： 不仅可测量各级代谢产物的组成， 也可对相关化合物进行定量分析， 从而可实时观测能源物质在大脑内代谢物某个位置13C含量， 并根据其随时间的变化获得糖类的代谢速率以及主要神经递质的传递动力学参数.

本文综述了现在主要的代谢动力学研究方法， 以及13C NMR波谱技术和间接测

定13C信号的1H-13C-NMR(Proton-Observed-Carbon-Edited， POCE)波谱技术， 并对2种技术进行了对比， 最后对体内代谢动力学研究的发展进行了展望. 1 大脑内能源物质代谢与主要神经递质传递之间的联系

能源物质(例如葡萄糖， 单羧基碳酸盐类)进入大脑， 通过三羧酸循环和神经递质的传递进行代谢， 产生生命过程所必需的能量(图1). 在复杂的代谢网络中， 许多代谢中间体对基础神经生物学、 神经和精神性疾病的研究具有重要意义， 包括谷氨酸、 谷氨酰胺和GABA等. 谷氨酸是大脑中最重要、 分布最广的兴奋性神经递质[13]， 它主要是在星形胶质细胞和神经元内通过三羧酸循环由α-酮戊二酸形成. 当谷氨酸能神经元兴奋时， 突触囊泡中的谷氨酸被释放入突触间隙与突触后神经元的谷氨酸受体结合， 由此启动谷氨酸能的神经传递， 之后大部分谷氨酸被星形胶质细胞所摄取， 同星形胶质细胞内的谷氨酸一起在谷氨酰胺合成酶的催化下， 生成谷氨酰胺. 谷氨酰胺一部分进入谷氨酸能神经元， 在谷氨酰胺酶作用下， 生成谷氨酸， 并贮存于突触囊泡中； 另一部分则汇入脑脊液. 形成星形胶质细胞与谷氨酸能神经元之间的谷氨酸-谷氨酰胺循环. GABA是大脑中最重要的抑制性神经递质， 主要是在GABA能神经元内由谷氨酸脱羧产生. GABA经转氨作用后的产物琥珀酸半醛可脱氢生成琥珀酸， 进入三羧酸循环而被氧化利用， 形成一条受GABA能神经活动影响的GABA代谢旁路(GABA shunt). 因此， 通过定量研究代谢网络， 不仅可获得相关的代谢信息， 也可确定大脑中主要神经递质释放/回收的动力学参数， 从而对基础神经生物学、 神经和精神疾病等的研究具有重要意义.

图1 能源物质[1-13C]-葡萄糖或[2-13C]-Acetate在大脑中代谢的主要途径： ●: 100% 13C富集的位置； 和 ： 第1次和第2次三羧酸循环后50% 13C富集的位置Fig.1 The main metabolic path of [1-13C]-glucose and [2-13C]-acetate in the brain: ●: Position of 100% 13C enrichment; and : Position of 50%

enrichment of 13C enrichment after the first and second TCA cycle 2 代谢动力学研究的基础理论

在代谢动力学研究中， 研究者一般采用13C标记的能源物质(葡萄糖或醋酸盐类)作为标记物来监测生物体系内代谢中间产物的变化. 在生物体内， 13C标记物和12C参与相同的的代谢过程， 但只有13C可以利用多种NMR技术进行定量测定， 从而从代谢中间产物中获得代谢和神经传递的动力学信息.

代谢速率的研究是基于简单的质量守恒定律来模拟13C时间序列的富集信息. 下面以一个简单的例子帮助我们更好地理解该方法的基本原理和具体过程[14]： (1)

(1)式中， S, P和Q分别代表3种不同的代谢产物， 物质S通过代谢速率V生成物质P， 物质P以同样的速率生成物质Q， 因此整个生命体系处于平衡状态. 物质P内13C的富集程度的信息主要由(2)、 (3)式描述出来： d[P]/dt=0 (2)

d[P*]/dt=([S*]/[S])V-([P*]/[P])V (3)

(3)式中*代表13C标记的物质. 如果物质P在生物体内有多种生成来源以及多种代谢途径， (2)、 (3)式就会变换为： (4) (5)

(5)式中[P]和[P*], [Si]和分别代表物质P和S的总浓度以及其13C标记物的浓度，

因此或[P*]/[P]则代表了13C标记物的富集程度. Vi和Vj分别代表物质P从不同代谢途径的生成和代谢速率. 当生物体体内的代谢速率达到平衡时， 物质守恒和同位素守恒也达到平衡. 在生物体能量代谢和神经传递动力学参数研究中， 根据图1内所涉及的神经递质及代谢网络所产生的物质与同位素守恒方程， 利用实验获得的代谢中间产物的浓度和富集程度的时间序列， 可以计算出能源物质的代谢速率及相关神经递质的动力学参数. 3 动物体内代谢动力学的研究方法 3.1 模型的选择 3.1.1 13C 标记途径

根据研究对象的不同以及能源物质输入生物体方式的不同， 主要分为以下几种模型. 在人体研究领域内， 主要分为静脉灌注[15,16]和口服[17]； 静脉灌注方法具有其特有的优点， 主要包括人体吸收13C标记物的速度快， 容易使体内代谢迅速达到平衡， 测量灵敏度高， 且容易控制血糖浓度等； 但该方法也存在一些自身无法克服的缺点， 如被测者在实验过程中需要在磁场内静躺2.5 h以上， 而且需要同时有2个静脉插管进入人体， 一个实时检测血糖浓度， 另外一个输入13C标记物， 这种实验条件对被测者来说是相当困难的， 因此很大程度上其应用. 口服13C标记物方法克服了以上缺点， 然而也有一些自身无法克服的缺点： 需要的13C标记物质量要远远大于前者， 检测灵敏度较低， 血糖浓度不易控制等. 因此， 人体研究中， 需要根据实验的具体情况及研究目的， 首先对能源供给方式进行选择. 在动物研究领域内， 主要分为股静脉插管， 颈静脉插管和尾静脉插管等. 其中股静脉插管在活体动物研究中应用较为广泛， 可以应用于清醒动物[18-20]或麻醉动物[21-23]. 研究清醒动物时， 由于动物一条腿的回血静脉被切断， 所以动物的行为受到了一定程度的， 对研究结果或多或少会有一些影响； 而在研究麻醉动物的时候该方法有其特有的优点： 可以通过监测股动脉内血液成分， 来调

节股静脉内13C标记物的输入速度， 同时对整个实验进行实时监控， 非常适合于体内动力学参数的研究. 该方法的缺点就是无法消除物对实验结果的影响. 颈静脉插管也可以用于清醒动物和麻醉动物[24]. 用于清醒动物研究时， 动物所受到的影响远小于股静脉插管. 对于麻醉动物研究， 由于颈静脉插管要比股静脉插管困难， 因此应用较少. 尾静脉插管是清醒动物研究最理想的选择[25]， 该方法动物所受到的刺激最小且创伤面最小， 可以较如实反映动物在正常生理状态下的代谢情况. 总之， 在神经代谢动力学研究中， 研究者需要根据研究课题的需要选择一个适宜的标记方法. 3.1.2 研究方式

能量代谢和神经传递动力学研究， 主要分为体内和体外2种方法， 以下分别对2种方法进行介绍. (i) 活体动物体内研究方法

对能量代谢和神经传递动力学的研究， 一般选择体内方法. 该方法可以利用一只动物得到不同时间段的代谢数据， 而大大减少了动物的使用数量. 该方法需要使用上述之一的插管方法， 以实施标记物的灌注和血液成分的监控. 手术后， 将麻醉的动物固定于相应的线圈-固定架组合体内， 置入磁场进行测量. 在测量过程中， 需要实时监控动物的体温与血液组成， 以便了解动物的生存状态.

该方法主要有以下几个问题需要解决： 1. 研究区域的准确定位. 目前主要的定位方法ISIS， STEAM和PRESS等[26]均可以对研究区域进行准确定位， 并在很大程度上消除边界效应的影响， 从而得到较好的研究结果. 2. 匀场. 在1H NMR研究中， 磁场的不均匀性造成水峰的展宽和水峰的不完全压制， 明显地影响实验结果. 3. 波谱峰面积的测量： 图2(a)为体内测量小鼠大脑的1H NMR谱图， 可以看出， 谱峰较宽， 造成峰的重叠， 从而需要特殊的方法进行测定. (ii) 体外研究方法

体内研究方法具有使用动物数目少和和实时监控的优点， 但也有检测灵敏度和谱分辨率低带来的较大的测量误差的缺点. 因此， 体外测定神经传递动力学的研究方法也就随之被引入到相关领域的研究. 该方法是在动物灌注标记的能源物质后， 在不同的时间点处死动物， 分离大脑， 获得相应脑区的组织， 提取匀浆后组织的小分子组分， 并纯化， 利用不同的检测方法进行定性和定量分析.

在代谢和神经传递动力学研究中， 大脑内代谢物质的含量和富集程度必须保持临死时的状态， 才能准确地对代谢速率进行分析. 然而， 动物在正常死亡或者实施一般方法处死后， 大脑内的代谢物质会有不同程度的改变(如图2(b)所示)： GABA在动物死亡后有明显变化[27-30]， 1～2 min之内变化最为显著， 4 min后达到平衡态[28]； 乳酸则发生更加显著的变化[31]， 浓度增长10倍以上[32]， 表明动物死后， 葡萄糖的代谢并没有停止， 而是以无氧代谢为主， 造成乳酸含量急剧累加； 另外对许多种动物包括人类的研究表明， 若干种氨基酸和琥珀酸在生物体死后5～30 min内也发生不同程度的增加[32]； 相对于其他代谢物的变化来说， 谷氨酸的变化比较小. 所以， 动物处死方法的选择对分析结果的真实性至关重要.

终止代谢过程的有效方法是使大脑内所有蛋白酶在处死动物的瞬间失活. 目前常用的失活的方法有低温速冻和高温加热. 低温速冻的方法[28]具有使用费用低， 设备简单的优点， 但是组织分离困难， 耗时长， 分离效果差， 以及蛋白酶失活不完全等诸多缺点. 瞬间高温加热一般使用微波聚焦加热的方法. 该方法具有操作简便易行， 动物死亡过程短(1 s左右)， 蛋白酶因永久性变性而失活， 大脑组织容易分离等优点[33， 34]， 但是所需设备昂贵. 该方法的谱图分辨率明显提高， 大多数物质的含量可通过直接积分或一些简单计算完成(图2(c)). Wang等人[25]利用尾静脉灌注和微波加热的方法对大鼠大脑各个区域的代谢动力学进行了研究， 获得了满意的结果.

注： tCr: Creatine+Phosphocreatine; Glx2: C2 in Glutamate+Glutamine; mI: myo-Inositol; Tau: Taurine; tCho: Choline+Phosphorylcholine; GABA4: C4 in GABA; Asp3: C3 in Aspartate; Gln4: C4 in Glutamine; Glu4: C4 in Glutamate; GABA2: C2 in GABA; Glx3: C3 in Glutamate and Glutamine; NAA: N-acetylaspartate+N-acetylaspartylglutamate; GABA3: C3 in GABA; Ala3: C3 in Alanine; Lac3: C3 in Lactate图2 小鼠大脑1H NMR谱图. (a) 体内1H NMR波谱图; (b) 体外1H NMR波谱图(脱臼死); (c) 体外1H NMR波谱图(微波)Fig.2 1H NMR spectroscopy in the mouse brain. (a) in vivo NMR spectroscopy; (b) in vitro 1H NMR spectroscopy (dislocation); (c) in vitro 1H NMR spectroscopy (microwave) 3.2 试剂的选择

3.2.1 [1-13C]-葡萄糖和[1， 6-13C]-葡萄糖

能量代谢和神经传递动力学研究中， 应用最为普遍的标记物为[1-13C]-葡萄糖. 它是所有可以用于生物体体内动力学研究中最经济的13C标记物， 且能够很快的被生物体吸收， 并迅速转化成[4-13C]-谷氨酸， 经过一段时间的代谢后， 其它重要组分均会不同程度的标记， 如： [n-13C]谷氨酸， [n-13C]-谷氨酰胺和[n-13C]-GABA(n=2， 3和4)， [m-13C]-天冬氨酸(m=2， 3)， 如图1所示. 通过分析不同时间序列的代谢物质的浓度和富集程度， 可定量测定代谢物的动力学参数， 从而揭示生物体内代谢状态. [1， 6-13C]-葡萄糖测量结果的灵敏度为[1-13C]-葡萄糖的2倍， 这2种物质的代谢途径完全相同， 标记物的区别在于葡萄糖初步代谢-糖酵解， 即 [3-13C]-丙酮酸的富集程度提高一倍， 但其昂贵的价格其广泛应用.

静脉注射[12, 15, 17, 35-39]或口服[17]上述标记物， 在生物体内转换成[4-13C]-谷氨酸并经神经传递过程形成[4-13C]-谷氨酰胺， 从而可对联接代谢动力学和神经传递动力学的谷氨酸-谷氨酰胺循环进行观测， 使[1-13C]-葡萄糖可用于代谢和神经传递动力学的研究. 3.2.2 [2-13C]-葡萄糖

[1-13C]-葡萄糖进入生物体内后， 大部分通过丙酮酸脱氢酶进入三羧酸循环， 形成[4-13C]-谷氨酰胺， 通过第2轮三羧酸循环形成[2-13C]-谷氨酰胺； 而小部分[1-13C]-葡萄糖通过丙酮酸羧化酶的无氧代谢进入三羧酸循环形成[2-13C]-谷氨酰胺. 由于无法区分来自两种途径的[2-13C]-谷氨酰胺， [1-13C]-葡萄糖不能应用于研究糖类物质的无氧代谢速率.

无氧代谢速率问题可通过[2-13C]-葡萄糖得到有效解决. [2-13C]-葡萄糖进入生物体内后， 大部分通过丙酮酸脱氢酶进入三羧酸循环形成[5-13C]-谷氨酰胺， 下一轮三羧酸循环后该标记以13CO2的形式释放到体外； 小部分[2-13C]-葡萄糖则经过丙酮酸羧化酶的无氧代谢进入三羧酸循环， 形成[3-13C]-谷氨酰胺. 因此定量测定[3-13C]-谷氨酰胺的富集程度和浓度可获得糖类的无氧代谢速率. Sibson等人[40]和Mason等人[37]分别通过该物质对大鼠和人体体内糖类的无氧代谢速率进行了研究， 结果均表明大脑中有氧谷氨酸-谷氨酰胺循环代谢为糖类代谢的主要途径， 而无氧呼吸仅为糖类代谢的一小部分. 3.2.3 [2-13C]-醋酸钠

葡萄糖既可被星形胶质细胞， 也可被神经元所代谢， 但目前的代谢动力学研究不能定量分析星形胶质细胞和神经元内葡萄糖的代谢速率. [2-13C]-醋酸钠(Acetate)是解决这个问题的有效试剂. 研究表明， 几乎全部的[2-13C]-Acetate通过血脑屏障进入星形胶质细胞并被代谢[41]. [2-13C]-Acetate首先标记胶质细胞内的代谢中间产物， 然后通过谷氨酸-谷氨酰胺循环或谷氨酸-GABA循环依次标记谷氨酸

能神经元或GABA能神经元内的代谢中间产物 (图 1). 通过分析不同时间序列的代谢物的浓度和富集程度， 可获得代谢和神经传递动力学参数. 利用[2-13C]-Acetate， Lebon等人[42]对人体大脑星形胶质细胞和神经元内糖类代谢的速率进行比较显示， 星形胶质细胞三羧酸循环为大脑整体有氧代谢的14%； Patel等人[39]对大鼠大脑GABA能神经元和谷氨酸能神经元内糖类代谢的研究表明GABA\\谷氨酸循环占据整体神经递质物质代谢循环(GABA\\谷氨酸和谷氨酸\\谷氨酰胺)的23% 和神经元三羧酸循环整体的18%. 3.3 能源物质代谢中间产物的测定

无论是活体体内检测， 还是体外检测， 均需要适合的方法对标记的代谢中间产物的富集程度和浓度进行有效的测定， 从而获得相关的神经传递动力学参数. 一般来说， 用于检测的手段主要有以下2种： 直接13C检测的13C NMR和间接13C检测的1H-[13C]-NMR. 下面对这2种方法做一简介： 3.3.1 13C NMR波谱测定

13C标记物被生物体吸收、 代谢形成含有13C标记的各种代谢中间产物. 其中大多数中间产物的浓度低于NMR的检测限 (0.1 mmol/kg)， 例如[3-13C]-丙酮酸， [4-13C]-酮戊二酸等； 但几种重要的神经递质， 例如谷氨酸， 谷氨酰胺， GABA等可为NMR检测. 在代谢动力学研究中， NMR是目前应用最广的技术. 利用13C NMR波谱， 可直接测定代谢物所含有的13C组分. 13C谱无核间耦合(13C-13C间)， 弛豫时间较长以及对磁场均匀度的敏感程度较低， 谱峰重叠现象没有1H谱严重， 这些优点使13C NMR成为研究代谢和神经传递动力学的重要工具[43,44].

3.3.2 1H-[13C]-NMR波谱测定 (i) 原理

13C NMR波谱的高分辨， 即使在较低的磁场强度下也可以很好的区分各代谢物，

但其低灵敏度需要较大的样品量和较长的检测时间， 其在代谢动力学研究中的应用.

现用于体内NMR检测方法主要有以下几种： Nuclear Overhauser

Enhancement (NOE)； polarization transfer和1H-[13C]-NMR. 其中NOE和polarization transfer方法为改进了的13C NMR， 可以将13C的灵敏度提高几倍， 是现在体内13C NMR应用最为广泛的检测方法[17, 45-47]. 但这2种方法的灵敏度仍然不足， 而1H-[13C]-NMR检测方法通过检测与13C相连的质子信号， 可将检测灵敏度提高约14倍[48]. 随着NMR技术的发展， 例如匀场技术的提高， 信号定量和空间定位技术的发展以及磁场场强的提高， 使该方法越来越多的应用到代谢动力学研究中. 在此仅做简介(详见文献[49-52])：

通过13C标记物在大脑内的代谢， 各种代谢中间产物为含有一定比例13C标记物的12C和13C混合物. 虽然1H与12C不存在耦合， 但1H与13C之间的耦合， 把与13C相连的1H成2个对称的二重峰， 位于与12C相连的1H的波谱峰两侧， 很易分辨(图3(b)). 但代谢组分在1H NMR谱中化学位移主要分布在0～5之间， 信号重叠严重， 一般的方法难以有效地区分与12C和13C相连的质子峰. 1H-[13C]-NMR可以较满意地解决这一问题. 该方法主要是通过一个自旋回波序列实现的(图3(a))： 首先对研究样品施加一个90° 1H脉冲， 经时间τ(1/JC-H)后， 附加180° 1H脉冲， 再经时间τ后， 回波开始形成. 通过对此回波信号的收集和傅立叶变换从而形成空间域内的谱序列. 回波信号收集过程中， 若加上13C去耦合方法， 则所研究物质内13C耦合的1H波谱峰和未耦合的1H重合到一起， 形成一个波谱(图3(c)(1H(12C+13C)))； 若在180° 1H脉冲的同时在再施加一个180° 13C脉冲， 则与13C耦合的质子峰会倒置， 再加一个13C去耦合方法后， 与13C相连和与12C相连的质子峰则会相减， 形成一个新的谱峰(图

3(c)(1H(12C-13C))). 波谱信号收集完成后， 利用2个谱峰相加则得到12C的信

息， 相减则得到13C的信息. 理论上讲， 氢谱的灵敏度是碳谱的4倍， 而此方法又可以使灵敏度提高4倍， 因此该方法能够使检测灵敏度提高16倍左右. (ii) 实验结果分析方法简介

利用1H-[13C]-NMR方法得到活体或体外谱后， 必须采用相应的方法进行数据分析. 体外谱的分析过程比较简单， 通过NMR仪器操作软件， 例如XWinNMR， Topspin和Varian等， 就可获得代谢物的定量信息. 由于受到体内复杂环境的影响以及谱峰的重叠， 活体谱代谢物的分析远为困难.

在活体谱分析中， LCMODEL是应用最为广泛的方法[53-55]. 该方法[53]利用代谢组分的体外谱的线性组合， 调节组分体外谱强度， 用非线性最小二乘方法对拟和结果进行分析， 获得与活体谱吻合最佳的组合谱， 从而确定各组分的浓度. 在拟合过程中， 需要考虑以下几个因素： 1)由于环境的差别， 可能需要根据活体谱的实际情况对组合谱中各组分的峰宽和化学位移作适当调整； 2)由于体内波谱存在着生物大分子的干扰， 需要对组合谱引入一个恰当的基线； 3)适当调整活体谱的相位.

图3 1H-[13C]-NMR原理介绍([3-13C]-乳酸和乳酸)Fig.3 Theory of 1H-[13C]-NMR ([3-13C]-lactate and lactate) 3.4 神经传递动力学参数的测算

对上述方法获得的能源物质代谢中间产物的浓度和13C标记物随时间变化的富集程度两组数据的数字模拟可测算出生物体大脑内的神经传递动力学参数[14]. 由于大脑中代谢网络的复杂性， 在建立计算模型时需要对其进行适当的简化以便获得神经传递动力学参数. 这些简化包括： 其一， 体内代谢组分的总浓度不随13C-标记物的灌注而改变， 从而可将质量守恒定律应用于每个组分的生成和代谢. 研究结果表明这一假设基本符合实际状态[25]； 其二， 那些快速转化的代谢组分对， 如： glucose-6-phosphate和fructose-6-phosphate， lactate和

pyruvate等， 视为等同， 合并为一个组分. 这一假设符合反应动力学原理. 基于以上简化， 对图1所示的胶质细胞-谷氨酸能神经元-GABA能神经元三元体系的代谢网络按照物质守恒和标记物守恒列出相应的守恒方程(详见文献[25])； 而活体谱研究中常用的星形胶质细胞-神经元二元体系， 所涉及的方程详见文献[38]. 根据这些方程以及NMR所获得的代谢组分浓度和富集程度的信息， 进行数据拟和. 目前应用最广的拟和方法是结合Levenburg-Marquardt算法与模拟退火算法所建立的一套数据拟和算法[17, 56, 57]. 4 活体谱技术的应用及展望

大脑内能量代谢和神经传递动力学方法的建立对于研究大脑功能以及与其密切相关的神经性异常疾病具有重要的意义. 由上述可知， 在灵敏度方面， 1H-[13C]-NMR波谱方法较13C NMR方法有显著的提高， 因此在能量代谢和神经传递动力学研究领域内应用较广. 主要包括研究大脑中最重要的抑制性神经递质GABA的代谢以及其抑制神经传递的过程； 结合脑功能成像， 研究伴随着谷氨酸和GABA浓度和神经递质物质循环速率的改变所发生的脑功能改变； 以及研究神经递质的改变(浓度和速率)在脑功能紊乱中的作用.

Rothman等人[58]和de Graaf等人[23]分别通过活体 1H NMR方法研究了人和大鼠大脑内GABA的相对含量； 测算了大鼠大脑内GABA的形成和代谢速率[23]； 揭示了一些神经性紊乱疾病， 如： 癫痫症[59]、 精神抑郁症[60]及酒精中毒[61]等， 伴随GABA浓度的改变和GABA能神经元的代谢速率异常. Shulman研究小组[13, 36, 38, 62, 63]利用活体1H-[13C]-NMR和13C NMR谱研究了不同生理状态下大脑皮层内葡萄糖代谢过程和谷氨酸能神经元活动之间的关系， 发现二者之间的计量比近乎1∶1， 表明大脑内的代谢所产生的能量大部分用于维持神经元的功能性活动.

活体谱技术研究是一种发展趋势， 因为它能够直接应用到人体研究领域， 进行疾

病学研究， 为人类的健康做出贡献. 然而， 该方法存在着一定的固有的局限性， 需要探索一些新技术新方法加以改进. 例如： 1) 由于核磁技术的本身特点， 例如灵敏度不高， 空间分辨率较差以及样品检测限较高等， 对生物体内含量较低的代谢物不能进行定量分析； 2) 由于体内物质的干扰及GABA含量的， 采用活体谱测量GABA的技术尚不完善， 因此对于GABA神经元的代谢特征尚无法预测； 3) 现有的技术不能很好的分离谷氨酸及谷氨酰胺的波谱信号， 尚不能完全意义上实现活体代谢动力学研究. 上述主要是需要从以下几个方面入手进行解决： 1) 从硬件入手提高磁场强度， 就可以相应的提高检测灵敏度以及空间分辨率等； 2) 使用NMR研究方法实现活体定量测定结构类似的化合物， 例如谷氨酸、 谷氨酰胺及肌酸类化合物等等， 需要设计新型的磁共振定量分析方法， 同时对现有的匀场技术进行提高， 进而提高NMR方法的检测限； 3) 通过与其他方法的联合弥补其不足. 在体外代谢动力学研究方法中， 可以使用色谱与NMR方法联合， 这样可以对代谢物质的含量进行定量测定， 而且测量的代谢物的种类也会有很大程度上的提升； 体内代谢动力学研究中， 尚需要探索一些新型的研究方法进行定量研究. 另外， 在大脑新陈代谢应用方面， 研究人员已利用[1-13C]-葡萄糖， [1， 6-13C2]-葡萄糖， [2-13C]-葡萄糖以及[2-13C]-醋酸钠对人体及啮齿类动物大脑皮层的三元代谢模型(图1)进行了预测， 构建了令人满意的代谢模型； 然而由于活体体内波谱测量技术的， 对嗅球、 下丘脑、 海马等其他重要脑区却没有进行系统的研究. 随着上述研究方法的发展， 相信这些脑区的能量代谢和神经传递动力学研究方法也会随之建立起来， 从而勾画出大脑内的能量代谢和神经传递的网络. 该网络的成功建立， 对于脑功能紊乱及精神神经性疾病的诊断及治疗具有非常重要的应用前景. 5 总结

本文主要从以下几个方面对目前研究体内代谢和神经传递动力学的NMR研究方法

进行了介绍： (1)能源物质如何在生物体内转化为神经递质物质以及此类物质如何在大脑神经元及胶质细胞内进行传递； (2)详细介绍了如何根据试验目的进行相应的试验设计， 同时采取何种动物模型进行新陈代谢和神经传递动力学研究； (3)生物体体内及体外代谢物质浓度及代谢速率的定量测定及计算方法. 此类方法是神经科学研究中的一种强有力的工具， 可定量地获得大脑能量代谢和神经传递动力学信息， 研究困扰人类已久的神经性疾病和精神性疾病的分子生化机制， 从而促进对大脑奥秘的揭示， 同时为脑疾病的准确预警、 早检、 诊断和有效的药物研发、 预防及治疗提供有效的策略. 参考文献:

【相关文献】

[1] Brambilla P, Perez J, Barale F, et al. GABAergic dysfunction in mood disorders [J]. Mol Psychiatr, 2003, 8(8): 721-737.

[2] Lewis D A, Hashimoto T, Volk D W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia [J]. Nat Rev Neurosci, 2005, 6(4): 312-324.

[3] Fukuyama H, Ogawa M, Yamauchi H, et al. Altered cerebral energy metabolism in alzheimer's disease: A PET study [J]. J Nucl Med, 1994, 35(1): 1-6.

[4] Holthoff V A, Beuthien-Baumann B, Kalbe E, et al. Regional cerebral metabolism in early Alzheimer's disease with clinically significant apathy or depression [J]. Biol Psychiatr, 2005, 57(4): 412-421.

[5] Ishii K, Sasaki M, Kitagaki H, et al. Reduction of cerebellar glucose metabolism in advanced alzheimer's disease [J]. J Nucl Med, 1997, 38(6): 925-928.

[6] Yamaguchi S, Meguro K, Itoh M, et al. Decreased cortical glucose metabolism

correlates with hippocampal atrophy in Alzheimer's disease as shown by MRI and PET [J]. J Neurol Neurosurg Psychiatr, 1997, 62(6): 596-600.

[7] de Graaf R A, Mason G F, Patel A B, et al. In vivo 1H-[13C]-NMR spectroscopy of cerebral metabolism [J]. NMR Biomed, 2003, 16(6/7): 339-357.

[8] Sokoloff L, Reivich M, Kennedy C, et al. The [14C] Deoxyglucose method for the measurement of local cerebral glucose utilization: Theory, procedure, and normal values

in the conscious and anesthetized albino rat [J]. J Neurochem, 1977, 28(5): 7-916. [9] Jack C R, Jr Shiung M M, Gunter J L, et al. Comparison of different MRI brain atrophy rate measures with clinical disease progression in AD [J]. Neurology, 2004, 62(4): 591-600. [10] Shulman R G. Functional imaging studies: Linking mind and basic neuroscience [J]. Am J Psychiatry, 2001, 158(1): 11-20.

[11] Cohen S M, Rognstad R, Shulman R G, et al. A comparison of 13C nuclear magnetic resonance and 14C tracer studies of hepatic metabolism [J]. J Biol Chem, 1981, 256(7): 3428-3432.

[12] Rothman D L, Behar K L, Hetherington H P, et al. 1H-Observe/13C-decouple

spectroscopic measurements of lactate and glutamate in the rat brain in vivo [J]. Proc Nati Acad Sci USA, 1985, 82(6): 1 633-1 637.

[13] Magistretti P J, Pellerin L, Rothman D L, et al. NEUROSCIENCE: Energy on Demand [J]. Science, 1999, 283(01): 496-497.

[14] Mason G F, Rothman D L. Basic principles of metabolic modeling of NMR 13C

isotopic turnover to determine rates of brain metabolism in vivo [J]. Metab Eng, 2004, 6(1): 75-84.

[15] Gruetter R, Novotny E J, Boulware S D, et al. Localized C-13 NMR-Spectroscopy in the human brain of amino-acid labeling from D-[1-13C] Glucose [J]. J Neurochem, 1994, 63(4): 1 377-1 385.

[16] Gruetter R, Novotny E J, Boulware, S D, et al. Direct measurement of brain glucose-concentrations in humans by C-13 NMR-spectroscopy [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, (24): 12 208-12 208.

[17] Mason G F, Falk Petersen K, de Graaf R A, et al. A comparison of 13C NMR

measurements of the rates of glutamine synthesis and the tricarboxylic acid cycle during oral and intravenous administration of [1-13C] glucose [J]. Brain Res Protoc, 2003, 10(3): 181-190.

[18] London E D, Cascella N G, Wong D F, et al. Cocaine-induced redoppuction of glucose utilization in human brain: A study using positron emission tomography and [Fluorine 18]-fluorodeoxyglucose [J]. Arch Gen Psychiatry, 1990, 47(6): 567-574.

[19] London E D, Connolly R J, Szikszay M, et al. Effects of nicotine on local cerebral glucose-utilization in the rat [J]. J Neurosci, 1988, 8(10): 3 920-3 928.

[20] Marenco T, Bernstein S, Cumming P, et al. Effects of nicotine and chlorisondamine on cerebral glucose utilization in immobilized and freely-moving rats [J]. Br J Pharmacol, 2000, 129(1): 147-155.

[21] Jiang L, Herzog R I, Mason G F, et al. Recurrent antecedent hypoglycemia alters neuronal oxidative metabolism in vivo [J]. Diabetes, 2009, 58(6): 1 266-1 274.

[22] Patel A B, Chowdhury G M I, de Graaf R A, et al. Cerebral pyruvate carboxylase flux is

unaltered during bicuculline-seizures [J]. J Neurosci Res, 2005, 79(1/2): 128-138. [23] de Graaf R A, Patel A B, de Graaf R A, et al. Acute regulation of steady-state GABA levels following GABA-transaminase inhibition in rat cerebral cortex [J]. Neurochem Int, 2006, 48(6/7): 508-514.

[24] Bhattacharya P, Harris K, Lin A, et al. Ultra-fast three dimensional imaging of hyperpolarized 13C in vivo [J]. Magma Magn Reson Mater Phys Biol Med, 2005, 18(5): 245-256.

[25] Wang J, Jiang L, Jiang Y, et al. Regional metabolite levels and turnover in the awake rat brain under the influence of nicotine [J]. J Neuochem, 2010, 113(6): 1 447-1 458. [26] de Graaf R A. In Vivo NMR Spectroscopy, 2nd Edition: Principles and Techniques[M]. John Wiley & Sons, Ltd, 2007.

[27] Erdö S L. Postmortem increase of GABA levels in peripheral rat tissues: Prevention by 3-mercapto-propionic acid [J]. J Neural Transm, 1984, 60(3): 303-314.

[28] Alderman J L, Shellenberger M K. γ-Aminobutyric acid (GABA) in the rat brain: re-evaluation of sampling procedures and the post-mortem increase [J]. J Neurochem, 1974, 22(6): 937-940.

[29] Lovell R A, Elliott S J, Elliott K A C. The α-aminobutyric acid and factor I content of brain [J]. J Neurochem, 1963, 10(7): 479-488.

[30] Minard F N, Mushahwar I K. Synthesis of [gamma]-aminobutyric acid from a pool of glutamic acid in brain after decapitation [J]. Life Sci, 1966, 5(15): 1 409-1 413.

[31] Higuchi T, Fernandez E J, Maudsley A A, et al. Mapping of cerebral metabolites in rats by 1H magnetic resonance spectroscopic imaging. Distribution of metabolites in normal brain and postmortem changes [J]. NMR Biomed, 1993, 6(5): 311-317.

[32] Petroff O A C, Ogino T, Alger J R. High-resolution proton magnetic resonance spectroscopy of rabbit brain: Regional metabolite levels and postmortem changes [J]. J Neurochem, 1988, 51(1): 163-171.

[33] Merritt J H, Frazer J W. Microwave fixation of brain-tissue as a neurochemical technique - review [J]. J Microw Power Electromagn Energy, 1977, 12(2): 133-139. [34] de Graaf R A, Chowdhury G M I, Brown P B, et al. In situ 3D magnetic resonance metabolic imaging of microwave-irradiated rodent brain: a new tool for metabolomics research [J]. J Neurochem, 2009, 109(2): 494-501.

[35] de Graaf R A, Brown P B, Mason G F, et al. Detection of [1, 6-13C2]-glucose metabolism in rat brain by in vivo 1H-[13C]-NMR spectroscopy [J]. Magn Reson Med, 2003, 49(1): 37-46.

[36] de Graaf R A, Mason G F, Patel A B, et al. Regional glucose metabolism and glutamatergic neurotransmission in rat brain in vivo [J]. Proc Nati Cad Sci USA, 2004, 101(34): 12 700-12 705.

[37] Mason G F, Petersen K F, de Graaf R A, et al. Measurements of the anaplerotic rate in the human cerebral cortex using 13C magnetic resonance spectroscopy and [1-13C] and [2-13C] glucose [J]. J Neurochem, 2007, 100(1): 73-86.

[38] Patel A B, de Graaf R A, Mason G F, et al. Glutamatergic neurotransmission and neuronal glucose oxidation are coupled during intense neuronal activation [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2004, 24(9): 972-985.

[39] Patel A B, de Graaf R A, Mason G F, et al. The contribution of GABA to

glutamate/glutamine cycling and energy metabolism in the rat cortex in vivo [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(15): 5 588-5 593.

[40] Sibson N R, Mason G F, Shen J, et al. In vivo 13C NMR measurement of

neurotransmitter glutamate cycling, anaplerosis and TCA cycle flux in rat brain during [2-13C]glucose infusion [J]. J Neurochem, 2001, 76(4): 975-9.

[41] Waniewski R A, Martin D L. Preferential utilization of acetate by astrocytes is attributable to transport [J]. J Neurosci, 1998, 18(14): 5 225-5 233.

[42] Lebon V, Petersen K F, Cline G W, et al. Astroglial contribution to brain energy metabolism in humans revealed by 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy: Elucidation of the dominant pathway for neurotransmitter glutamate repletion and measurement of astrocytic oxidative metabolism [J]. J Neurosci, 2002, 22(5): 1 523-1 531. [43] Shen J, Rothman D L, Behar K L, et al. Determination of the glutamate-glutamine cycling flux using two-compartment dynamic metabolic modeling is sensitive to astroglial dilution [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2009, 29(1): 108-118.

[44] Blüml S, Moreno-Torres A, Shic F, et al. Tricarboxylic acid cycle of glia in the in vivo human brain [J]. NMR Biomed, 2002, 15(1): 1-5.

[45] Shen J, Petersen K F, Behar K L, et al. Determination of the rate of the

glutamate/glutamine cycle in the human brain by in vivo 13C NMR [J]. Proc Nati Cad Sci USA, 1999, 96(14): 8 235-8 240.

[46] Gruetter R, Seaquist E R, Ugurbil K. A mathematical model of compartmentalized neurotransmitter metabolism in the human brain [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2001, 281(1): E100-E112.

[47] Pan J W, de Graaf R A, Petersen K F, et al. [2, 4-13C2]-β-Hydroxybutyrate metabolism in human brain [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22(7): 0-8.

[48] Jr E J N, Ogino T, Rothman D L, et al. Direct carbon versus proton heteronuclear editing of 2-13C ethanol in rabbit brain in vivo: A sensitivity comparison [J]. Magn Reson Med, 1990, 16(3): 431-443.

[49] Brindle K M, Boyd J, Campbell I D, et al. Observation of carbon labelling in cell

metabolites using proton spin echo NMR [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1982, 109(3): 8-871.

[50] Sillerud L O, Alger J R, Shulman R G. High-resolution proton NMR studies of intracellular metabolites in yeast using 13C decoupling [J]. J Magn Reson, 1981, 45(1): 142-150.

[51] Foxall D L, Cohen J S, Tschudin R G. Selective observation of 13C-enriched metabolites by 1H NMR [J]. J Magn Reson, 1983, 51(2): 330-334.

[52] Ogino T, Arata Y, Fujiwara S. Proton correlation nuclear magnetic resonance study of metabolic regulations and pyruvate transport in anaerobic Escherichia coli cells [J]. Biochem, 1980, 19(16): 3 684-3 691.

[53] Provencher S W. Estimation of metabolite concentrations from localized in vivo proton NMR spectra [J]. Magn Reson Med, 1993, 30(6): 672-679.

[] de Graaf A A, Bovée W M M J. Improved quantification of in vivo 1H NMR spectra by optimization of signal acquisition and processing and by incorporation of prior knowledge into the spectral fitting [J]. Mag Reson Med, 1990, 15(2): 305-319.

[55] Eijsden P v, Behar K L, Mason G F, et al. In vivo neurochemical profiling of rat brain by [1H-13C] NMR spectroscopy: cerebral energetics and glutamatergic/GABAergic neurotransmission [J]. J Neurochem, 2010, 112(1): 24-33.

[56] Mason G F, CWave: Software for the Design and Analysis of 13C Labeling Studies Performed In Vivo[C]. ISMRM. Denver, CO. 2000, 1870.

[57] Alcolea A, Carrera J, Medina A. A hybrid Marquardt-Simulated Annealing method for solving the groundwater inverse problem [J]. Calibrat Reliab Groundwater Model, 2000, 265: 157-163.

[58] Rothman D L, Petroff O A, Behar K L, et al. Localized 1H NMR measurements of gamma-aminobutyric acid in human brain in vivo [J]. Proc Nati Cad Sci USA, 1993, 90(12): 5 662-5 666.

[59] Petroff O A C, Behar K L, Mattson R H, et al. Human brain γ-aminobutyric acid levels and seizure control following initiation of vigabatrin therapy [J]. J Neurochem, 1996, 67(6): 2 399-2 404.

[60] Sanacora G, Mason G F, Rothman D L, et al. Reduced cortical γ-aminobutyric acid levels in depressed patients determined by proton magnetic resonance spectroscopy [J]. Arch Gen Psychiatry, 1999, 56(11): 1 043-1 047.

[61] Behar K L, Rothman D L, Petersen K F, et al. Preliminary evidence of low cortical GABA levels in localized 1H-MR spectra of alcohol-dependent and hepatic encephalopathy patients [J]. Am J Psychiatry, 1999, 156(6): 952-9.

[62] Sibson N R, Dhankhar A, Mason G F, et al. Stoichiometric coupling of brain glucose metabolism and glutamatergic neuronal activity [J]. Proc Nati Cad Sci USA, 1998, 95(1): 316-321.

[63] Patel A B, Graaf R A d, Mason G F, et al. Coupling of glutamatergic neurotransmission

and neuronal glucose oxidation over the entire range of cerebral cortex activity [J]. Ann N Y Acad Sci, 2003, 1003: 452-453.