２０１４年第４期 闽南师范大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．） Ｎｏ．４．２０１４年 Ｇｅｎｅｒａｌ Ｎｏ．８６ （总第８６期） ＭＳ２病毒样颗粒原核表达优化及颗粒稳定性能测试 张国广 ，欧阳莹。，刘 颖 ，黄小君 ，陈亮 （１．闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州，３６３０００；２．￣ｆｑ大学生命科学学院，福建厦门，３６１００５） 摘 要：ＭＳ２噬茵体病毒样颗粒广泛用于构建ＲＮＡ病毒检测中的阳性对照品．本文基于已构建的表达栽体 ｐＣＰＨＡ，优化了表达载体在ＢＬ２１（ＤＥ３）细胞中的表达条件．结果表明在ＬＢ培养基中，茵液ＯＤ￣ｏ＝０．９时。加入 ＩＰＴＧ诱导６ｈ，外壳蛋白的表达量达到最大，电镜下观察到表达出的产物呈现ＭＳ２噬茵体病毒颗粒结构．该病毒 样颗粒在常温下至少可以保存６０ ｄ，６４￣Ｃ温度时３０ ｍｉｎ内结构保持稳定． 关键词：ＭＳ２噬茵体；病毒样颗粒：表达量优化：稳定性能 中图分类号：Ｑ７８６ 文献标志码：Ａ 文章编号：２０９５—７１２２（２０１４ Ｊ０４—００６２—０５ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＭＳ２ Ｐｈａｇｅ ａｎｄ Ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ＺＨＡＮＧ Ｇｕｏ—ｇｕａｎｇ ，ｏｕ Ｙａｎｇ—ｙｉｎｇ ，ＬＩＵ Ｙｉｎｇ ，ＨＵＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｊｉｌｎ ，ＣＨＥＮ Ｌｉａｎｇ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３６３０００，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｍｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ ３６１００５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｖｉｒｕｓ—ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ ＭＳ２ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｗａｓ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｍｌ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ．Ｓｅｖｅｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌ ｃｏｎｄｉｉｔｏｎｓ ｏｆ ｐＣＰＨＡ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｐａｃｋ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ０－ＩＡ１ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｎｓｉｄｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＩ２１（ＤＥ３）ｃｅｌ１．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｒｅａｃｈｅｓ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｔ ｔｈｅ ｂｒｏｔｈ ０Ｄ彻ｏｆ ０．９，ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ６ｈ ａｎｄ ＬＢ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｈｅｔ ｓａｍｅ ａｓ ＭＳ２ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｎｄｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ａｔ ｎｏｒｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ａｔ ｌｅａｓｔ ６０ｄ ａｎｄ ６４℃ｆｏｒ ａｔ ｌｅａｓｔ ３０ｍｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＭＳ２ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ；ｖｉｕｓ－ｌｒｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｓｔａｂｉｌｉｔｙ 大肠杆菌ＭＳ２噬菌体是一种球状病毒，其基因组是全长３６５９ ｂｐ的单链ＲＮＡ构成，基因组上主要由 四种蛋白基因组成，分别为编码成熟酶蛋白（或Ａ蛋白）、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白的基因，蛋白质 是病毒外壳的主要成分，１８０拷贝的外壳蛋白和一拷贝的成熟蛋白组成一个完整的病毒外壳，基因组 ＲＮＡ被包裹在外壳蛋白内【”．研究文献报道构建出的原核表达载体中在多克隆位点按照顺序插入５ 非编 码序列、成熟酶蛋白基因和外壳蛋白基因序列后，ＩＰＴＧ诱导能够得到和野生噬菌体形态相同的病毒样颗 粒（ｖｉｒｕｓａｌ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ，ＶＬＰ），该颗粒内部能够包裹ＲＮＡ分子，且具有耐核酸酶的特性［２－７］．如果将一段外 源基因片段插入到包装位点的下游，对表达载体进行诱导表达，在表达出蛋白的同时可以将噬菌体自身 基因组和外源基因片段转录成ＲＮＡ，而后进行的病毒颗粒组装时可以将上述转录出的ＲＮＡ包装入病毒 颗粒内形成所谓的盔甲ＲＮＡ（Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ）［２－￣．盔甲ＲＮＡ技术被广泛应用于ＲＮＡ病毒检测中质控品的 收稿日期：２０１４－－０６一Ｉ１ 作者简介：张国广（１９７３－）．男．河南省遂平县人．副教授 ・为通讯作者． －６２・ 张国广，欧阳莹，刘颖，黄小君，陈亮：ＭＳ２病毒样颗粒原核表达优化及颗粒稳定性能测试第４期 构建［２－７］，人们认为这种蛋白一ＲＮＡ复合体的结构与ＲＮＡ病毒相似，在进行病毒检测操作时基本能准确体 现病毒ＲＮＡ的提取过程，能大大减少操作过程中出现的错误率，另外这种病毒样颗粒自身无法复制，具 有很好的生物安全性．之前按照文献 步骤在构建高致病性Ｈ５Ｎ１禽流感病毒实时荧光ＰＣＲ检测的质控 品时发现【７】，构建的载体在原核细胞内诱导表达时假病毒颗粒产量较低，本文探讨了几种因素对原核细胞 基因工程表达菌株ＭＳ２外壳蛋白表达量的影响，同时测试了诱导表达出的假病毒颗粒的稳定性能． １材料与方法 １．１实验材料 ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ，ｐＣＰＨＡｔｎ表达载体为之前构建保存于本实验室；ＤＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅＡ和ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ 等试剂购自大连宝生物工程有限公司；ＩＰＴＧ、氨苄青霉素和Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ购自生工生物工程（上海）股份 有限公司；５ｘ蛋白缓冲液、ＳＤＳ—ＰＡＧＥ配制溶液、磷酸盐缓冲液和电转缓冲液等均按分子克隆实验指南［８］ 进行配制． １．２实验方法 １．２．１ ｐＣＰＨＡ的原核表达、表达产物的纯化及颗粒形态观察 将保存的测序正确的ｐＣＰＨＡ表达载体转化ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ，挑取阳性克隆扩大培养，加入ＩＰＴＧ诱 导表达６ｈ；离心收集菌体沉淀，用ＰＢＳ缓冲液重悬，冰浴中超声破碎至清亮，离心收集上清，得到ｐＣＰＨＡ 的诱导表达产物．即溶解于上清液中的包裹Ｈ５Ｎ１ ＨＡ片段ＲＮＡ的ＭＳ２ ＶＬＰ．ＶＬＰ初步纯化方案采用文 献【８】从大规模裂解物中制备 噬菌体颗粒章节中用ＰＥＧ沉淀噬菌体颗粒的步骤进行．将初步纯化的产 物用蔗糖密度梯度离心进一步纯化后，用醋酸铀染色５ ｒａｉｎ，自然干燥２ ｈ，在扫描电镜（ＪＳＭ６３９Ｏ）下观察 其形态，以上操作参考文献ｆ４１． １．２．２病毒样颗粒发酵产量的优化 病毒样颗粒发酵产量的优化中外壳蛋白表达量的比较是通过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳后，观察凝胶上外壳蛋 白条带亮度的方法进行．不同条件表达出的蛋白均经过ＰＥＧ初步纯化后，取样品溶液２０ Ｌ与蛋白上样 缓冲液混匀，沸水中煮５ ｍｉｎ，取１０ Ｌ进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，在操作过程中保持所有步骤的同步性与可 比性，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ操作步骤参照文献【８】． １．２．２．１不同培养基对外壳蛋白产量的影响 将活化的ｐＣＰＨＡ菌株分别培养在高浓度肉汤培养基，ＬＢ液体培养基，ｐＭＡＬ液体培养基及ＳＯＣ液 体培养基中，均振荡培养至ＯＤ６００为０．９后加入ＩＰＴＧ至终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ，相同条件下，诱导表达６ ｈ． １．２．２．２ ＩＰＴＧ加入时菌液ＯＤ值及诱导时间对外壳蛋白产量的影响 在ＬＢ液体培养基中（氨苄青霉素抗性）接种活化的ｐＣＰＨＡ菌株，３７℃振荡培养，在ＯＤ６００值为０．５、 ０．６、０．７、０．８、０．９、１．０时，分别加人ＩＰＴＧ至终浓度为１ ｍｍｏｌ／Ｌ，诱导表达６ ｈ．ＬＢ液体培养的ｐＣＰＨＡ菌株 振荡培养至ＯＤ６００值为０．９时加人ＩＰＴＧ，在相同条件下，分别诱导表达３ ｈ、４ ｈ、５ ｈ、６ ｈ，７ ｈ、１６ ｈ． １．２．３病毒样颗粒的时间稳定性和热稳定性测试 将１５管１００ Ｌ经过初步纯化的ｖＬＰ溶液分别放置于三种温度条件下（室温、４￣Ｃ、一２０￣Ｃ），分别在第 ９ ｄ、１８ ｄ、３０ ｄ、６０ ｄ和第９０ ｄ时，通过凝胶电泳观察颗粒中所包裹的ＲＮＡ的条带亮度，判断ＶＬＰ的时间 稳定性．将超声破碎后表达产物于３７℃、４５℃、６４。Ｉ＝、７２℃水浴中各放置３０ ｒａｉｎ后琼脂糖凝胶电泳观察其 所包裹的ＲＮＡ的条带亮度，判断ＶＬＰ的热稳定性． ２结果与分析 ２．１ ｐＣＰＨＡ表达载体的表达 ｐＣＰＨＡ表达载体转化ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ后构建的工程菌株加入ＩＰＴＧ诱导表达６ ｈ后的产物，经系列 纯化后在扫描电镜下可以观察到直径大约为２６ ｎｍ的颗粒状蛋白粒子（图１），其形态与ＭＳ２病毒颗粒类 似，表明本研究构建的ｐＣＰＨＡ工程菌株经诱导后可以表达出预期的ＶＬＰ． ・６３・ 闽南师范大学学报（自然科学版） ３结论与讨论 ＭＳ２噬菌体被广泛用于制备ＲＮＡ病毒检测的质控品，但其在大肠杆菌中的表达量却需要提高，本研 究对之前构建的ｐＣＰＨＡ工程菌株表达量进行了优化，探讨了培养基、加入诱导物时菌液浓度及诱导表达 时间对外壳蛋白表达的影响，ＬＢ、ｐＭＡＬ、ＳＯＣ培养基均适合用于该工程菌株表达，工程菌株的初始诱导 ０Ｄ鲫为０．９时开始加入ＩＰＴＧ，诱导６ｈ后外壳蛋白的表达量可以达到最大，经过优化后假病毒颗粒的产量 得到一定程度的提高．病毒样颗粒的时间稳定性和耐热性检测结果表明该病毒样颗粒在长时间存放和高 温处理中能有效对其内部包裹的ＲＮＡ进行保护．根据本文对ＶＬＰ热稳定性的研究结果优化了工程菌超 声破碎上清液中ＲＮＡ、细胞碎片及杂质蛋白去除这一步骤．采用将细胞破碎液４５℃静置３０ ｍｉｎ或３７ 中 放置８ ｈ，用菌体破碎液中细菌自身的核糖核酸酶消化其中的ＲＮＡ；然后放入６４℃水浴中处理３０ ｍｉｎ，在 ６４ 温度下细胞碎片及其它一些杂蛋白也会很快变性而沉淀下来，有利于后续对假病毒颗粒的纯化．文献 『２—６】一般都是通过加入过量ＲＮａｓｅ Ａ后３７℃消化除去的细菌菌体破碎液中ＲＮＡ杂质的，大量制备中添 加过量ＲＮａｓｅ Ａ进行ＲＮＡ的消化会增加成本．采用优化方案后既降低了纯化成本又简化了操作． 参考文献： ［１］贾盘兴．噬茵体分子生物学——基本知识和技能【Ｍ】．北京：科学出版社，２００１． ［２］Ｐａｓｌｏｓｋｅ Ｂ Ｌ，Ｗａｌｋｅｒｐｅａｃｈ Ｃ Ｒ，Ｏｂｅｒｍｏｅｎｅｒ Ｒ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｆｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｎｄｓｔａｎｄａｒｄｓ【Ｊ】．Ｊ Ｃｈｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，３６（１２）：３５９０—３５９４． ［３ Ｃｈｅｎｇ ３］Ｙａｎｇｊｉａｎ，Ｎｉｕ Ｊｉａｎｊｕｎ，Ｚｈａｎｇ Ｙｏｎｇｙｏｕ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｓ－Ｔａｇｇｅｄ ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ ｐｈａｇｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａ８ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆ ｏｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂ— ｉｏｌｏｇｙ，２００６，４４（１０）：３５５７－３５６１． ［４】窦 敏，张国广，于广福，等．舍口蹄疫病毒ＩＲＥＳ ＲＮＡ病毒样颗粒表达栽体的构建叨．中国生物工程杂志，２００７，２７（９）： ３１－３５． 【５］Ｚｈａｎ Ｓｉｅｎ，Ｌｉ Ｊｉｎｍｉｎｇ，Ｘｕ Ｒｕｉｈｕａｎ，ｅｔ ａ１．Ａｒｍｏｒｅｄ ｌｏｎｇ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ ａｓｓａｙ ｏｒｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎ０ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｅｓｒ ｔｙｐｅ ｌ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，４７（８）：２５７１—２５７６． 【６］Ｓｏｎｇ Ｌｉｑｉｏｎｇ，Ｓｕｎ Ｓｈｉｐｅｎｇ，Ｌｉ Ｂｏ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ ｅｎｔｅｒｏｖｉｍｓ ７１ ａｎｄ ｅｏｘｓａｅｋｉｅｖｉｍｓ Ａ１６ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ＰＥＲ ｕｓｉｎｇ ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ ａ８ ａ ｖｉｅｓｒ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆ ｏｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１ １，４９（１０）：３５９１— ３５９５． ［７］张国广，郭迟呜，欧阳莹，等．病毒样颗粒为阳性对照的Ｈ５Ｎ１荧光定量ＰＥＲ检测方法的建立忉．厦门大学学报：自然科 学版，２０１４，５３（３）：４１６—４２１． 【８］Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｍｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄａｖｉｄ Ｗ．分子克隆实验指南【Ｍ】．第三版．黄培堂等译．北京：科学出版社，２００２． ［责任编辑：喻玉萍］ ・６６・
