用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法[发明专利]

*CN101942478A*

(10)申请公布号 CN 101942478 A(43)申请公布日 2011.01.12

(12)发明专利申请

(21)申请号 201010266983.5(22)申请日 2010.08.31

(71)申请人上海交通大学

地址200240 上海市闵行区东川路800号(72)发明人张大兵 申慧峰 梁婉琪 袁政(74)专利代理机构上海交达专利事务所 31201

代理人王锡麟 王桂忠(51)Int.Cl.

C12N 15/70(2006.01)C12N 15/(2006.01)C12N 15/67(2006.01)

权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 3 页

()发明名称

用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法(57)摘要

一种生物工程技术领域的用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法，该质粒为pET30e，其DNA序列如Seq ID No.1所示；通过将质粒模板与引物组进行PCR扩增后获得的扩增产物与pMD18-T载体连接，经转化大肠杆菌DH5α后获得大肠杆菌克隆体，将大肠杆菌克隆体作为底物进行酶切连接后将得到的产物转化大肠杆菌DH5α，获得可溶性表达质粒分子；应用方法：将获得的表达质粒分子，用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组大肠杆菌菌落，经接种培养得到菌体细胞后实现可溶性表达的提高。本发明对于帮助外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有促进作用，对进一步的分析这些蛋白的功能具有重要的意义。CN 101942478 ACN 101942478 ACN 101942483 A

权 利 要 求 书

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1.一种用于外源蛋白可溶性表达的质粒，其特征在于，该质粒为pET30e，其DNA序列如Seq ID No.1所示。

2.一种根据权利要求1所述质粒的制备方法，其特征在于，通过将质粒模板与引物组进行PCR扩增后获得的扩增产物与pMD18-T克隆载体连接，经转化大肠杆菌DH5α后获得大肠杆菌克隆载体体，将大肠杆菌克隆在体作为模板进行酶切和大肠杆菌表达载体连接后将得到的产物转化大肠杆菌DH5α，获得用于外源蛋白可溶性表达的质粒pET30e。

3.根据权利要求2所述的质粒的制备方法，其特征是，所述的将质粒模板与引物组进行PCR扩增是指采用以下三种方式中任意一种得以实现：

a)将F4ac型ETEC野生型菌株C83907质粒与第一引物和第二引物进行PCR扩增；b)将含有霍乱毒素B亚基(CTB)基因的质粒pETctb与第三引物和第四引物进行PCR扩增；

c)将含有过氧化物酶前体(PRX)基因的质粒pET32a-prx-24与第五引物和第六引物进行PCR扩增。

4.根据权利要求3所述的质粒的制备方法，其特征是，所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该序列包含一个Nde I性内切酶识别位点。

5.根据权利要求3所述的质粒的制备方法，其特征是，所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，该序列包含一个BamH I性内切酶识别位点和一个大肠杆菌核糖体结合位点。

6.根据权利要求3所述的质粒的制备方法，其特征是，所述的第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，该序列包含一个BamH I性内切酶识别位点。

7.根据权利要求3所述的质粒的制备方法，其特征是，所述的第四引物核苷酸序列如SEQID NO.7所示，该序列包含一个Xho I性内切酶识别位点。

8.根据权利要求3所述的质粒的制备方法，其特征是，所述的第五引物核苷酸序列如SEQID NO.8所示，该序列包含一个BamH I性内切酶识别位点。

9.根据权利要求3所述的质粒的制备方法，其特征是，所述的第六引物核苷酸序列如SEQID NO.9所示，该序列包含一个Xho I性内切酶识别位点。

10.根据权利要求2所述的质粒的制备方法，其特征是，所述的酶切是指：a)用性内切酶Nde I和BamH I酶切，获得740bp的片段与用性内切酶Nde I和BamH I酶切后的pET30a载体进行连接；或

b)用BamH I和Xho I酶切，获得309bp的片段与采用BamH I和Xho I酶切后的pET30e载体进行连接。

11.一种根据上述任一权利要求所述的质粒的应用方法，其特征在于，将获得的可溶性表达质粒分子，用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组大肠杆菌菌落，经接种培养得到菌体细胞后实现可溶性表达的提高。

12.根据权利要求11所述的质粒的应用方法，其特征是，所述的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞通过以下方式制备获得：从新活化的SOB-Mg固体培养基平板上挑取BL21(DE3)单菌落于50mL SOB-Mg液体培养基中，37℃剧烈振荡培养，至OD600＝0.3时，将细菌转移到一个无菌的，冰预冷的80mL的离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却到0℃，5,000rpm，4℃，离心5min，尽量倒清培养液；加入30mL预冷的0.1M CaCl2溶液悬浮菌体；冰上放置

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权 利 要 求 书

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20min；5,000rpm，4℃，离心5min，小心倒去上清，1/2原培养基体积的0.1M CaCl2(加入20％的甘油)重新悬浮菌体，1001μL/管分装后直接用于转化或者液氮速冻后，-70℃储存。

13.根据权利要求11所述的质粒的应用方法，其特征是，所述的热激法转化是指：取大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞置于冰上融化，然后加入待转化的质粒，混匀后冰上放置30min；42℃，热激90sec；热激后迅速置于冰上冷却10min；加入100μL无抗液体LB培养基，37℃振荡培养45min将200μL菌液全部涂布在加有相应抗生素的固体LB培养基上；37℃培养16hr。

14.根据权利要求11所述的质粒的应用方法，其特征是，所述的接种培养是指：挑取重组大肠杆菌菌落接入3-5mL含卡那霉素50mg/L的LB培养液，于37℃振荡培养过夜，按1∶100的接种量将过夜培养物接入100mL含卡那霉素50mg/L的LB培养液，37℃振荡培养至对数中期OD595＝0.5-0.6，并以1∶1000的比例加入1M IPTG，37℃振荡培养3-5h，4℃8,000rpm离心10min收集菌体细胞。

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说 明 书

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用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的质粒及其制备和应用方法，具体是一种利用产肠毒素大肠杆菌FaeE基因提高外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的质粒及其制备和应用方法。

[0001]

背景技术

大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒和宿

主多等特点，在基因工程技术领域成为首选的表达系统。但是外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体。目前国内外对蛋白质体外复性研究较多，但其过程往往费时、费力，且不经济，因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。

[0003] 提高外源基因大肠杆菌中可溶性表达可以通过共表达的辅助蛋白，例如分子伴侣GroEL/ES和DnaK-DnaJ-GrpE、引发因子(Trigger factor)、硫氧还蛋白(Thioredoxin)和折叠酶(Foldase)等以增加外源蛋白可溶性。但是应根据外源蛋白的特点有选择性地共表达分子伴侣和折叠酶。例如在大肠杆菌表达热激蛋白GroEL/ES能增加某些蛋白(α-1，6-岩藻糖基转移酶、浸麻芽孢杆菌环式糊精葡聚糖转移酶、谷氨酸消旋酶、过氧化物歧化酶、酪氨酸激酶、人胶原酶原)的可溶性，却对其他一些蛋白(人I型干扰素受体2c亚基的胞外段、噬菌体P22结构蛋白、人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白)无增溶效果。又如GroEL/ES与人酪氨酸激酶Lck共表达并不能增加后者的可溶性，而硫氧还蛋白却能显著地促进该外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。除此之外，温度也可能会对共表达折叠辅助蛋白的效果产生重要的影响。例如preS2-S’-β-半乳糖苷酶与DnaK和DnaJ分子伴侣共表达，能在30至42℃范围内提高可溶蛋白的表达水平，而共表达GroEL和GroES分子伴侣却只能在30℃条件下取得比较好的效果。值得一提的是，如果将几种折叠辅助蛋白分子同时共表达，有可能获得比单独表达某种折叠辅助蛋白更好的效果。Jiro等将GroEI/ES，Trx或DsbBD与谷氨酸消旋酶同时共表达，活性谷氨酸消旋酶的产量上升了2.2至2.3倍。在某些情况下，共表达那些能增加蛋白可溶性和促进大肠杆菌生长的蛋白也能起到良好的效果。例如Kallio等在大肠杆菌表达透明颤菌血红蛋白，发现该蛋白对活性蛋白的表达有明显促进作用。

[0004] FaeE是产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白上的一个分子伴侣，在体内以同源二聚体的形式与鞭毛蛋白的其他亚基形成异源三聚体，从而保护这些亚基免受蛋白酶的降解，同时抑制这些亚基提前聚合，并将它们护送到跨膜蛋白。

[0002]

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法，该方法构建了一个包含有该分子伴侣FaeE的大肠杆菌表达载体，可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。

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说 明 书

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本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 本发明涉及一种用于外源蛋白可溶性表达的质粒，该质粒为pET30e其DNA序列如Seq IDNo.1所示，

[0008] 所述的质粒包含有分子伴侣FaeE的编码序列，含有BamH I，EcoR I，Sac I，Sal I，Not I，Xho I性内切酶识别位点组成的多克隆位点，其分子伴侣FaeE的编码序列包括有起始密码子ATG和终止密码子TAA，分子伴侣FaeE的编码序列和外源基因序列之间有一个大肠杆菌核糖体结合位点，分子伴侣FaeE的编码序列和外源基因序列共同受T7启动子和lac操纵子的，外源基因序列末端与6个His-tag基因融合；[0009] 本发明涉及上述用于外源蛋白可溶性表达的质粒的制备方法，通过将质粒模板与引物组进行PCR扩增后获得的扩增产物与pMD18-T载体连接，经转化大肠杆菌DH5α后获得大肠杆菌克隆体，将大肠杆菌克隆体作为底物进行酶切连接后将得到的产物转化大肠杆菌DH5α，获得可溶性表达质粒分子。

[0010] 所述的大肠杆菌DH5α购自上海英骏生物技术有限公司；[0011] 所述的pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司；[0012] 所述的将质粒模板与引物组进行PCR扩增是指：

[0013] a)将F4ac型ETEC野生型菌株C83907质粒与第一引物和第二引物进行PCR扩增；或

[0014] b)将含有霍乱毒素B亚基(CTB)基因的质粒pETctb与第三引物和第四引物进行PCR扩增；或

[0015] c)将含有过氧化物酶前体(PRX)基因的质粒pET32a-prx-24与第五引物和第六引物进行PCR扩增。

[0016] 所述的F4ac型ETEC野生菌株C83907购自中国兽药监察所(China Institute of VeterinaryDrug Control)；

[0017] 所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该序列包含一个Nde I性内切酶识别位点。

[0018] 所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，该序列包含一个BamH I性内切酶识别位点和一个大肠杆菌核糖体结合位点。

[0019] 所述的第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，该序列包含一个BamH I性内切酶识别位点。

所述的第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，该序列包含一个Xho I

性内切酶识别位点。

[0021] 所述的第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，该序列包含一个BamH I性内切酶识别位点。

[0022] 所述的第六引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，该序列包含一个Xho I性内切酶识别位点。

[0023] 所述的酶切连接是指：

[0024] a)用性内切酶Nde I和BamH I酶切，获得740bp的片段与用性内切酶Nde I和BamH I酶切后的pET30a载体进行连接；或[0025] b)用BamH I和Xho I酶切，获得309bp的片段与采用BamH I和Xho I酶切后的

[0020]

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说 明 书

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pET30e载体进行连接。

[0026] 所述的pET30a质粒购自上海美季生物技术有限公司；

[0027] 本发明涉及上述用于外源蛋白可溶性表达的质粒的应用方法，将获得的可溶性表达质粒分子，用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组大肠杆菌菌落，经接种培养得到菌体细胞后实现可溶性表达的提高。

[0028] 所述的大肠杆菌BL21(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司；

[0029] 所述的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞通过以下方式制备获得：从新活化的SOB-Mg固体培养基平板上挑取BL21(DE3)单菌落于50mL SOB-Mg液体培养基中，37℃剧烈振荡培养，至OD600＝0.3时，将细菌转移到一个无菌的，冰预冷的80mL的离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却到0℃。5,000rpm，4℃，离心5min，尽量倒清培养液；加入30mL预冷的0.1MCaCl2溶液悬浮菌体；冰上放置20min；5,000rpm，4℃，离心5min。小心倒去上清，1/2原培养基体积的0.1M CaCl2(加入20％的甘油)重新悬浮菌体。100μL/管分装后直接用于转化或者液氮速冻后，-70℃储存。[0030] 所述的热激法转化是指：取大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞置于冰上融化，然后加入待转化的质粒，混匀后冰上放置30min；42℃，热激90sec；热激后迅速置于冰上冷却10min；加入100μL无抗液体LB培养基，37℃振荡培养45min；将200μL菌液全部涂布在加有相应抗生素的固体LB培养基上；37℃培养16hr。[0031] 所述的接种培养是指：挑取重组大肠杆菌菌落接入3-5mL含卡那霉素50mg/L的LB培养液，于37℃振荡培养过夜。按1∶100的接种量将过夜培养物接入100mL含卡那霉素50mg/L的LB培养液，37℃振荡培养至对数中期OD595＝0.5-0.6，并以1∶1000的比例加入1M IPTG，37℃振荡培养3-5h。4℃ 8,000rpm离心10min收集菌体细胞。[0032] 本发明与现有技术相比

[0033] 利用pET30e载体系统可以明显的提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。在本系统中CTB的可溶性表达提高了8.85％，PRX的可溶性表达提高了13.18％，所表达的可溶性蛋白具有生物学活性。同时本载体系统可以利用BamH I、EcoR I、Sac I、Sal I、Not I、Xho I等多克隆位点将外源基因克隆进本发明的载体pET30e中，利用载体3′端的6His-tag实现外源蛋白的快速纯化；表达的外源蛋白不与其他大的辅助蛋白融合，不需要进一步的处理。因此本系统对于帮助外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有促进作用，对进一步的分析这些蛋白的功能具有重要的意义。附图说明

图1为pET30e大肠杆菌表达载体示意图及分子伴侣FaeE在大肠杆菌中表达的

SDS-PAGE分析。

[0035] 图2为pET30e载体结构示意图。[0036] 图3为pET30eCTB载体结构示意图。[0037] 图4为pET30ePRX载体结构示意图。

[0038] 图5为pET30CTB和pET30eCTB在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE和Western blot分析。

[0039] 图6为pET30PRX和pET30ePRX在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE和Western blot

[0034]

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说 明 书

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分析。

[0040]

图7为GM1神经节糖苷酯ELISA结合试验分析pET30e表达系统中获得可溶的CTB图8为pET30e表达系统获得的过氧化物酶酶活测定及相对活性分析。

的活性。

[0041]

具体实施方式

[0042] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0043] 实施例1

[0044] pET30e大肠杆菌表达载体示意图及分子伴侣FaeE在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析

[0045] 分子伴侣FaeE编码序列通过Nde I和Bam HI两个性内切酶克隆进商业化的表达载体pET30a中，使该基因位于T7启动子和lac操纵子的制下，在分子伴侣编码序列的5’端添加了大肠杆菌核糖体结合位点，在该位点之后是可以用来进行外源蛋白基因克隆的多克隆位点，包括Bam HI，EcoR I，Sac I，Hind III，Not I，Xho I，在多克隆位点之后是6个组氨酸编码序列。外源基因通过T7终止子进行终止。载体结构如图1和图2。[0046] 将pET30a和获得的pET30e大肠杆菌表达载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，将重组大肠杆菌pET30a/BL21(DE3)和pET30e/BL21(DE3)的单菌落在100ml含有50μg/ml的卡那霉素的新鲜LB液体培养液在37℃下进行振荡培养，培养至OD590值为0.4时，加入IPTG至终浓度为1mmol/l进行诱导表达4hr。将诱导的和非诱导的大肠杆菌细胞在4℃下5,000rpm离心10min，收集的细胞沉淀重悬于10ml/g鲜重(FW)的PBS(pH7.4)中，在冰上进行超声波处理。超声波后的细胞裂解液在4℃下10,000rpm离心10min，收集上清液。取10μl的上清液进行SDS-PAGE电泳，然后进行考马氏兰染色。结果(图1B)显示在大肠杆菌中表达的FaeE大小为24.8kDa，与它的实际大小相符。[0047] 实施例2

[0048] pET30CTB和pET30eCTB在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE和Western blot分析[0049] 将CTB编码序列的编码序列，通过Bam HI和Xho I酶切克隆进用相同的酶切处理的pET30e中，获得表达载体pET30eCTB，载体结构如图3。

[0050] 所述的载体pET30eCTB质粒的DNA序列如Seq ID No.2所示，其中包含分子伴侣FaeE的编码序列和霍乱毒素B亚基CTB的编码序列，所述的霍乱毒素B亚基(CTB)编码序列是以古典型霍乱弧菌(CVC)基因组DNA为模板扩增获得。

[0051] 将pET30CTB和pET30eCTB转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌pET30CTB/BL21(DE3)和pET30eCTB/BL21(DE3)。细菌培养、蛋白诱导和处理的方法同实施例1，蛋白经SDS-PAGE进行分离，分离后将蛋白转移到纤维素膜(NC)上，然后膜与第一抗体His-tag的兔多克隆抗体(Proteintech Group，USA)(1∶2,000v/v)进行反应；然后再与碱性磷酸酶偶联的抗兔IgG(1∶1,000v/v)进行反应；膜经过漂洗后，采用含有nitroblue tetrazolium(NBT，Gibco)和5-bromo-2-chloro-3-indolyl phosphate(BCIP，Gibco)底物着色反应溶液进行着色反应；反应结束后采用灭菌重蒸水进行终止反应。

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说 明 书

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SDS-PAGE结果(图5A)显示，pET30CTB/BL21(DE3)和pET30eCTB/BL21(DE3)都可以表达11.9kDa的CTB蛋白，而且表达的6His-CTB主要是在这两个重组大肠杆菌表达蛋白的沉淀中存在，即，主要是以包涵体的形式存在的。而Western blot的结果(图5B)除了证明CTB除了在重组大肠杆菌pET30CTB/BL21(DE3)和pET30eCTB/BL21(DE3)中以包涵体的形式进行表达，而且还在pET30eCTB/BL21(DE3)中以可溶的形式表达。

[0052] 采用Ni-NTA亲和层析柱进行His6preS1融和蛋白的Ni-NTA(Novagen，USA)纯化，方法参照供应商提供的实验方案。并采用Bradford方法测定收集蛋白的浓度。结果表明，通过pET30e大肠杆菌表达载体系统表达的可溶的6His-CTB占重组大肠杆菌pET30eCTB/BL21(DE3)表达的总可溶蛋白的8.85％。而在重组大肠杆菌pET30CTB/BL21(DE3)表达的可溶的蛋白中，检测不到CTB蛋白的存在。即，通过pET30e大肠杆菌表达系统可以使表达的CTB的可溶性提高8.85％。[0053] 实施例3

[00] pET30PRX和pET30EPRX在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE和Western blot分析[0055] 将PRX的编码序列，通过Bam HI和Xho I酶切克隆进用相同的酶切处理的pET30e中，获得表达载体pET30ePRX，载体结构如图4。所述的载体pET30ePRX质粒的DNA序列如Seq ID No.3所示，包含分子伴侣FaeE的编码序列和水稻内源过氧化物酶的编码序列，所述的水稻内源过氧化物酶(PRX)基因序列是以水稻基因组DNA为模板扩增获得。

[0057] 将pET30PRX和pET30EPRX转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌pET30PRX/BL21(DE3)和pET30ePRX/BL21(DE3)。细菌培养、蛋白诱导和处理的方法同实施例1，Western blot分析方法同实施例2。SDS-PAGE结果(图6A)显示，pET30PRX/BL21(DE3)和pET30ePRX/BL21(DE3)都可以表达37.8kDa的PRX蛋白，而且表达的6His-PRX主要是在这两个重组大肠杆菌表达蛋白的沉淀中存在，即，主要是以包涵体的形式存在的。而Westernblot的结果(图6B)除了证明PRX除了在重组大肠杆菌pET30PRX/BL21(DE3)和pET30ePRX/BL21(DE3)中以包涵体的形式进行表达，而且还在pET30ePRX/BL21(DE3)中以可溶的形式表达。可溶的6His-PRX经纯化后分析得，该可溶的蛋白张重组大肠杆菌pET30ePRX/BL21(DE3)表达的总可溶蛋白的13.18％。而在重组大肠杆菌pET30PRX/BL21(DE3)表达的可溶的蛋白中，检测不到PRX蛋白的存在。即，通过pET30e大肠杆菌表达系统可以使表达的PRX的可溶性提高13.18％。[0058] 实施例4

[0059] GM1神经节糖苷酯ELISA结合试验分析pET30e表达系统中获得可溶的CTB的活性。

[0060] 用GM1-ELISA分析CTB蛋白的生物学活性。采用以下方法：用GM1(Sigma G271)包被96孔酶标板，同时用半乳糖(Gal)、BSA、PBS作为对照，4℃过夜后，将85ng CTB蛋白包被于已结合有GM1的酶标板上；用His-tag兔多克隆抗体做为一抗，碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG作为第二抗体，用NPP进行显色，终止反应后，用酶标仪(ELx800UV，BioTEK)测定各孔溶液的光吸收值，激发光波长为405nm。

[0056] [0061]

从图7的结果可以看出，纯化获得的pET30e大肠杆菌表达的可溶的6His-CTB与对照6His蛋白比较，与GM1神经节苷脂具有很强的结合能力，而且与对照半乳糖和BSA都

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说 明 书

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没有结合能力。CTB在体内天然的受体是神经节苷脂，CTB只有形成五聚体的形式，才能和它的受体进行结合，结果表明，获得的这种可溶的6His-CTB能够形成它天然的构象，所以可以与它的受体结合。[0062] 实施例5

[0063] pET30e表达系统获得的过氧化物酶酶活测定及相对活性分析。

过氧化物酶活性是用Amplex Red过氧化氢/过氧化物酶分析试剂盒(Molecular

Probes)进行分析，方法参照说明书。用0，25，37.5，50，62.5，75，87.5，and 100mU/mL的标准的HRP与Amplex Red反应混合物在30℃条件下进行反应60min的结果制定标准曲线。利用该标准曲线来计算6His-PRX和6His蛋白的相对活性。[0065] 从图8A的结果可以看出，pET30e表达系统获得的过氧化物酶可以催化H2O2释放出O2，并且6His-PRX的活性会随着反应时间的延长提高，虽然与商品化的HRP的活性比起来还有些差异。但是根据标准曲线计算的6His-PRX的相对活性为1.00μUmL-1pmol-1，与6His具有显著差异(P＜0.01)(图8B)。[0066] 实施例6

[0067] 本发明涉及上述用于提高外源基因在大肠杆菌中可溶性表达的质粒的应用方法，将获得的可溶性表达质粒分子，用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。挑取重组大肠杆菌菌落接入3-5mL含卡那霉素(50mg/L)的LB培养液，于37℃振荡培养过夜。按1∶100的接种量将过夜培养物接入100mL含卡那霉素(50mg/L)的LB培养液，37℃振荡培养至对数中期(OD595＝0.5-0.6)。以1∶1000的比例加入1M IPTG，37℃振荡培养3-5h。4℃ 8,000rpm离心10min收集菌体细胞。进行表达蛋白的可溶性分析和纯化。[0068] 所述的感受态细胞的制备方法为：从新活化的SOB-Mg固体培养基平板上挑取BL21(DE3)单菌落于50mL SOB-Mg液体培养基中，37℃剧烈振荡培养，至OD600＝0.3时，将细菌转移到一个无菌的，冰预冷的80mL的离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却到0℃。5,000rpm，4℃，离心5min，尽量倒清培养液；加入30mL预冷的0.1M CaCl2溶液悬浮菌体；冰上放置20min；5,000rpm，4℃，离心5min。小心倒去上清，1/2原培养基体积的0.1M CaCl2(加入20％的甘油)重新悬浮菌体。100μL/管分装后直接用于转化或者液氮速冻后，-70℃储存。

[0069] 所述的感受态细胞的转化方法为：取感受态细胞，置于冰上融化，然后加入待转化的质粒，混匀后冰上放置30min；42℃，热激90sec；热激后迅速置于冰上冷却10min；加入100μL无抗液体LB培养基，37℃振荡培养45min；将200μL菌液全部涂布在加有相应抗生

[00]

素的固体LB培养基上；37℃培养16hr。

[0070] 所述的蛋白纯化方法按照Novagen公司The pET System manual进行。纯化后的蛋白进行相关的活性分析。

[0071] 所述的可溶性分析方法为：用PBS(1mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)洗涤菌体两次，然后将菌体用PBS重悬后进行超声波破碎。然后在4℃条件下，12,000rpm离心30min。将上清和沉淀分开，沉淀用等体积的PBS重悬后进行分析。分别将上清和沉淀进行SDS-PAGE分析和Western blot分析。[0072] 所述的SDS-PAGE分析方法为：将收集的蛋白样品加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液(50mM Tis-HCl(pH6.8)，100mM二硫苏糖醇(DTT)，2％(m/V)SDS(电泳级)，0.1％溴

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酚蓝，10％(V/V)甘油)，沸水煮5-10min后，12,000rpm离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。

[0073] 所述的Western blot分析方法为：蛋白样品在SDS-PAGE电泳结束后将蛋白转移到纤维素(NC)膜上。200mA，转膜2hr，转移结束后关掉电源，取出NC膜放入容器(培养皿)中，加适量的封闭缓冲液(含5％(w/v)脱脂奶粉的PBS缓冲液)，室温轻轻摇动温育1-2hr。换新的培养皿，加入10mL上述封闭缓冲液稀释的一抗(1∶500稀释)，4℃温育2hr。PBS缓冲液洗涤三次，每次10min。将NC膜转移至另一培养皿中，加适量的二抗缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-Cl，pH7.5)，室温洗涤10min。倒去缓冲液，加入含有5％脱脂奶粉的上述二抗缓冲液，并以1∶5000量加入二抗(碱性磷酸酶偶联的羊抗兔IgG)，室温摇动温育1hr。再将NC膜转移至另一培养皿中，加适量的二抗缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-Cl，pH7.5)，室温洗涤三次，每次10min。加酶联抗体生色底物NBT/BCIP室温避光摇动温育。蛋白带颜色达到要求后，把膜转移到另一培养皿中，加终止液(40μL 0.5M EDTA，10mL PBS)终止反应。

[0074] 所述的活性分析方法包括利用本系统表达的CTB的活性分析和PRX的活性分析[0075] 本实施例采用了GM1-ELISA的方法分析CTB的活性，具体方法如下：用GM1(SigmaG271)包被96孔酶标板(BIO BASIC INC)，每孔2μg(PBS稀释，每孔100μL)；同时用半乳糖(Gal)、BSA、PBS作为对照，每个样品做3个重复，4℃过夜。弃尽包被物，重蒸水连续冲洗4次；1％ BSA(1g BSA溶于100mL PBS，pH7.4)封闭，室温下放置2-5hr。弃尽封闭液，重蒸水冲洗4次；将100ng CTB蛋白包被于已结合有GM1的酶标板上；37℃温育2hr；弃尽包被物，重蒸水冲洗4次；加入300μL封闭缓冲液(0.05％ Tween20，1mM EDTA，0.125％ BSA，0.17M H3BO4，0.12M NaCl，pH8.5)，25℃封闭30min，用重蒸水冲洗3次，再加入50μL用封闭缓冲液稀释的His-tag抗体，室温2hr；用重蒸水冲洗3次后，加入封闭缓冲液封闭10min，再用重蒸水冲洗3次，加入50μL用封闭缓冲液稀释的碱性磷酸酶偶联的第二抗体(1∶2000)，室温2hr；重蒸水冲洗3次后，加入75μL NPP溶液[5mg NPP溶于50μL重蒸水，用NPP缓冲液(0.11M甘氨酸，1mM MgCl2，1M ZnCl2，pH10.4)以1∶100比例稀释]；室温显色1hr后，加入25μL 0.5M NaOH终止反应；对照作相同处理。用酶标仪(ELx800UV，BioTEK)测定各孔溶液的光吸收值，激发光波长为405nm。

[0076] PRX活性采用Amplex Red过氧化氢/过氧化物酶分析试剂盒(Molecular Probes)进行分析，具体方法参照说明书。用1μg纯化的6His-PRX蛋白与Amplex Red反应混合物在30℃条件下进行反应，在SpectraMax 190(Molecular Devices)仪器上测定560nm的条件下的光吸收值。每1min采集一次，共采集60min，进行酶活分析。分别以2μg的6His蛋白和100mU/mL过氧化物酶(HRP)作为阴性和阳性对照。用0、25、37.5、50、62.5、75、87.5和100mU/mL的标准的HRP与Amplex Red反应混合物在30℃条件下进行反应60min的结果制定标准曲线。利用该标准曲线来计算6His-PRX和6His蛋白的相对活性。[0077] 总之，通过构建一个含有产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白中的一个分子伴侣亚基FaeE，可以提高外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达。通过CTB、PRX验证建立的系统，表明这两种蛋白在pET30e载体系统中可以获得可溶性表达，而且表达的可溶的CTB可以和它的受体结合，证明其形成了其天然的构象；表达的可溶的PRX也具有过氧化物酶的活性。

[0078]

因此，构建的这一载体在提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达方面具有重要

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作用，可以用于多种生物工程酶及生物医药的生产。

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图1

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图5

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图8

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