质粒大抽

质粒大抽protocol(用QIAGEN Maxi Column)

1. 从转染的细菌平板中挑取中等大小，饱满，而且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到 3ml选择性培养基，摇床培养14小时,225 rpm。

2. 从小量培养物中取1ml用作小量抽提，并且用小量抽提产物酶切鉴定，选取阳性克隆的 培养物，以1：1000接种到100 ml选择性LB培养基中，摇床培养14小时,225 rpm。

3. 从大量培养物中取700微升菌液和300微升甘油（灭菌）加入冻存管，放入液氮中，过 夜后，放入-70℃冰箱中。并且在stocklist中加入菌种的详细信息(stocklist 贴在冻存管的上方)。

4. 把100ml的菌液倒进250ml离心管中，4℃离心，6000g离心15分钟（No41 rotor 8500 rpm）。

5. 倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入4ml 4℃预冷的细胞重悬液buffer P1（确 定是否加了RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。然后将悬浮液转到50ml的离心管中。

6. 加入4ml细胞裂解液 buffer P2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4-6次，在室温下孵育不要超 过5分钟（从开始加P2时计时，时间太长会使质粒DNA断裂）。样品不要斡旋，buffer P2用毕也要及时盖好盖子，以免被空气中的CO2酸化。

7. 加入4ml 预冷的PH调节液buffer P3, 及时地而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀） 地颠倒混匀4-6次，在冰上孵育15分钟。后再一次混匀样品．20000g，4℃离

心30分钟（N046 rotor 18000 rpm）.若上清不够清需再离心15min. 此步可对上清取样240ul（sample 1）以备检测分析

8. 在层析柱的顶端加四层纱布，并且用buffer QBT润湿纱布。用4ml的buffer QBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。（正常情况8min可以流完）

9. 然后把7中的上清小心吸到层析柱中（不可将沉淀绕动），让液体自由流下。此步可取 样240ul（sample 2）以备检测分析

10. 用5ml buffer QC清洗层析柱一次，去掉纱布（去掉前，建议戴一次性手套挤一挤或用 头挤一挤），再加一次5ml buffer QC清洗层析柱。此步可取样400ul（sample 3）以备检测分析

11. 用8-10ml buffer QF洗脱DNA,用两只10ml的离心管分别收集洗脱液。此步可取样20ul （sample 4）以备检测分析；同时可再加5ml buffer QF洗柱，洗柱液保存至实验结束（sample 5）以备检测分析，接着按清洗方案洗柱。

12. 在两管洗脱液中各加入0.7倍(5×0.7=3.5 ml)体积的室温的异丙醇沉淀DNA,并在沉淀会 出现的位置做标记，离心前一定要蜗旋（vortex 8.5） 然后在4℃,15000g离心30分钟(No26 rotor 14300 rpm),取出时保持管平行移动，小心的倒去上清.注意:不要将沉淀倒掉.

13. 用2ml 室温的70％乙醇清洗沉淀(清洗沉淀盐及置换异丙醇), 4℃,15000g离心10分钟 (No26 rotor 14300rpm), 取出时保持管平行移动，小心倒掉上清. 注意:不要将

沉淀倒掉.更高要求时可再一次用乙醇清洗．

14. 在空气中干燥沉淀5-10分钟,用合适体积的TE（一般500ul）溶解沉淀.

附： 大抽用层析柱清洗方案

原则是按照使用时加液的相反顺序加液清洗。

1． 加QF 5ml让液体自由流下，此步要用无菌的10ml离心管收集，待取样检测。

2． 加QC 10 ml 让液体自由流下,重复一次

3． 加QBT 5ml

4． 重复 1,2,3,4步 一次

5． 清洗完毕后加放进50ml离心管中，盖好盖子保存 并在管上和柱子上表明质粒名称，使用次数（以写‘正’的方式标示）