1.0 目的 Purpose
标准菌种的管理与传代有一个比较规范的程序。
2.0 范围 Scope
上海11制药有限公司内的微生物实验室标准菌种的管理与传代。
3.0 适用文件 Applicable Document(s)
大肠杆菌检测标准操作程序„ChP法‟ SMB-102 铜绿假单胞菌检测标准操作程序„ChP法‟ SMB-103 金黄色葡萄球菌检测标准操作程序„ChP法‟ SMB-104 沙门菌检测标准操作程序„ChP法‟ SMB-105 大肠杆菌检测标准操作程序„JP法‟ SMB-112 铜绿假单胞菌检测标准操作程序„JP法‟ SMB-113 金黄色葡萄球菌检测标准操作程序„JP法‟ SMB-114 沙门菌检测标准操作程序„JP法‟ SMB-115 大肠菌群检测标准操作程序„Sankyo法‟ SMB-122 铜绿假单胞菌检测标准操作程序„Sankyo法‟ SMB-123 金黄色葡萄球菌检测标准操作程序„Sankyo法‟ SMB-124 革兰氏染色标准操作程序 SMB-001 培养基的营养试验 SMB-011
培养基配制与管理标准操作程序 SMB－007
4.0 相关部门 Responsible Section(s)
质量管理部
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5.0 物件准备
5.1 设备与仪器
接种环，生物安全柜，-80℃冷冻冰箱，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌器，5℃
冰箱，1ml菌种冷冻管，放菌种冷冻管的盒子，塑封袋，标明菌种名称、接种 日期及接种人的标签纸，1ml加样枪，烧杯，试管及配套硅胶塞，显微镜、水 浴锅
5.2 试剂及菌种
大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢
杆菌、黑曲酶菌、10%甘油，灭菌生理盐水，革兰氏染色液、0.1%亚甲蓝液 （注：本公司购入的菌种标准分为ATCC和CMCC两种）
5.3 培养基
营养琼脂培养基，营养肉汤培养基、酪蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂
培养基、酵母霉菌琼脂培养基
6.0 操作步骤
6.1 10%甘油的制备：
将甘油配制成10%浓度的溶液，然后用1ml加样枪，将10%的甘油溶液加到 1ml菌种冷冻管中，盖上菌种冷冻管盖子，但不能将盖子拧紧。再将盖上盖子 的菌种冷冻管放入烧杯内进行121℃、30分钟高压蒸汽灭菌。灭菌结束后， 将烧杯中的菌种冷冻管放入生物安全柜内，拧紧盖子放入放菌种冷冻管的盒子 内，再将盒子放入5℃冰箱保存，备用。
6.2 标准菌种制备与管理
6.2.1 标准菌种冷冻管的制备（第一代）
将新购入的标准菌种在24小时内移入以上制备好的10％灭菌甘油 内。即从5℃冰箱取出已准备好的10%灭菌甘油菌种冷冻管置于生物 安全柜内，用冷却灭菌接种环从标准菌种斜面上挑取1～2个菌落接
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种至10 %的灭菌甘油菌种冷冻管中，制成10的菌悬液，拧紧菌种冷 冻管的盖子放入相配套的塑封袋中，同时放入该菌的标签纸，再将放 有同一种菌的小的塑封袋放入一个较大的塑封袋中，放入－80℃带 锁的冰箱内。一般标准菌种在超低温冰箱内能保存5年，平均每年 每种菌用4支冷冻管，每三个月用一支冷冻管。
6.2.2 第二、三代工作菌种的制备：
6.2.2.1 从超低温冰箱中取出所需的菌种冷冻管，置于35～40℃的
水浴中进行解冻1分钟。
6.2.2.2 解冻后，放入生物安全柜内，用冷却后的灭菌接种环从冷冻
管中取一环菌液接种于10ml灭菌营养肉汤培养基中，置于 35～37℃的培养箱内18～24小时，进行增菌培养。„第二 代‟
6.2.2.3 培养后，用冷却的灭菌接种环从增菌液中沾取一环接种于相
应的培养基斜面上贴上菌种标签，置于35～37℃的培养箱内 18～24小时，进行培养。„注：第三代接种出的斜面
数量是根据该月的该菌种的用量进行接种。菌种有效期以接 入斜面培养基日起一个月。‟
6.2.2.4 培养后，进行革兰氏染色镜检并观察其菌落形态特征。确认
符合后置于5℃的冰箱内保存。使用时将培养出的斜面用
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5ml的灭菌生理盐水将斜面上的菌落洗下制成10菌悬液使 用。„第三代‟
6.2.2.5 在第三代菌种有效期内进行第四代的接种传代。
6.2.3 第四、五代工作菌种的制备：
6.2.3.1 从5℃的冰箱内取出第三代工作菌种，用冷却的灭菌接种环
挑取1个菌落接种于相应的琼脂斜面培养基中，置于35～37 ℃的培养箱内培养18～24小时后，进行革兰氏染色镜检同 时观察其菌落形态特征。确认符合后置于5℃的冰箱内作为 第四代工作菌种保存，备用。„注：第四代接种出的斜面数 量是根据该月的该菌种的用量进行接种的。菌种有效期以接 入斜面培养基日起一个月。‟
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6.2.3.2 同上进行第五代工作菌种的接种传代。有效期以接入斜面培
养基日起一个月。
6.3 第三代ATCC工作菌种的管理与传代
6.3.1 第三代ATCC工作菌种环的管理
将新购入的菌种外包装上的菌种名称、批号、编号、有效期和供应商提 供的产品质量证书上的菌种名称、批号、编号、有效期进行核对。 核对无误后将菌种放入5℃的冰箱内保存。各菌种的产品质量证书归档 保存。此时保存于5℃冰箱内的菌种有效期按外包装上注明的有效期确 定。
6.3.2 第三代ATCC工作菌种的传代
6.3.2.1 第三代ATCC工作菌种的制备
由于本公司购入的第三代ATCC工作菌种是以接种环的形式保
存的，使用时我们将保存在5℃冰箱内的含有相应菌种的菌种 罐拿出，然后将含有菌种接种环的箔纸包装袋从罐中取出，一 个箔纸包装袋中装有一根接种环，最后在生物安全柜内将接种 环从箔纸包装袋中取出直接接种于相应的培养基斜面或平板 上，贴上菌种标签，置于35～37℃的培养箱内18～24小时， 进行培养。培养后，进行革兰氏染色镜检并观察其菌落形态特 征，确认符合后放入5℃冰箱内保存，备用。„注：第三代接 种出的斜面数量是根据该月的该菌种的用量进行接种的，菌种 有效期以接种日起一个月。）
6.3.2.2 第四、五代ATCC工作菌种的制备：
6.3.2.2.1 从5℃的冰箱内取出第三代ATCC工作菌种，用冷却的
灭菌接种环挑取1个菌落接种于相应的琼脂斜面培养 基中，置于35～37℃的培养箱内培养18～24小时后 进行革兰氏染色镜检并观察其菌落形态特征。确认其 符合后置于5℃的冰箱内作为第四代ATCC工作菌种保 存，备用。„注：第四代接种出的斜面数量是根据该 月的该菌种的用量进行接种的。菌种有效期以接种日
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6.3.2.2.2 同上进行第五代ATCC工作菌种的接种与第四代
ATCC工作菌种的灭菌。菌种有效期也以接种日起一个月。
6.4 第三代ATCC工作菌种的冷冻管制备和传代
6.4.1 第三代ATCC工作菌种冷冻管的制备
6.4.1.1 第三代ATCC工作菌种的制备
由于本公司购入的第三代工作菌种是以接种环的形式保存的， 使用时我们将保存在5℃冰箱内的含有相应菌种的菌种罐拿 出，然后将含有菌种接种环的箔纸包装袋从灌中取出，一个箔 纸包装袋中装有一根接种环，最后在生物安全柜内将接种环从 箔纸包装袋中取出直接接种于相应的培养基斜面，贴上菌种标 签，置于35～37℃的培养箱内18～24小时，进行培养。然后 进行革兰氏染色镜检并观察其菌落形态特征。确认符合后置于 5℃冰箱。
6.4.1.2 第三代工作菌种冷冻管的制备
将以上培养基斜面上的第三代工作菌种24小时内移入以上制备 好的10％灭菌甘油内。即从5℃冰箱取出已准备好的10%灭菌 甘油菌种冷冻管置于生物安全柜内，用冷却灭菌接种环从标准 菌种斜面上挑取1～2个菌落接种至10 %的灭菌甘油菌种冷冻
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管中，制成10的菌悬液，拧紧菌种冷冻管的盖子放入相配套 的塑封袋中，同时放入该菌的标签纸，再将放有同一种菌的小 的塑封袋放入一个较大的塑封袋中，放入－80℃带锁的冰箱 内。一般标准菌种在超低温冰箱内能保存5年，平均每年每种 菌用12支冷冻管，每一个月用一支冷冻管。
6.4.2 第四代、第五代ATCC工作菌种的制备
6.4.2.1 从超低温冰箱中取出所需的菌种冷冻管，置于35～40℃的
水浴中进行解冻1分钟。
6.4.2.2 解冻后，放入生物安全柜内，用冷却后的灭菌接种环从冷冻
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上海11制药 标 题 标准菌种的管理与传代程序 有限公司 :SMB004 : : 3 :共 10 页 文件号码 发行日期 版本号码 第 6 页 管中取一环菌液接种于10ml灭菌营养肉汤培养基中，置于 35～37℃的培养箱内18～24小时，进行增菌培养。„第四 代‟
6.4.2.3 培养后，用冷却的灭菌接种环从增菌液中取出一环接种于相
应的培养基斜面上贴上菌种标签，置于35～37℃的培养箱内 18～24小时，进行培养。„注：第五代接种出的斜面数量是 根据该月的该菌种的用量进行接种。菌种有效期以接入斜面 培养基日起一个月。‟
6.4.2.4 培养后进行革兰氏染色镜检并观察其菌落形态特征。确认符
合后置于5℃的冰箱内保存，备用。使用时将培养出的斜面用
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5ml的灭菌生理盐水将斜面上的菌落洗下制成10菌悬液使用。„第五代‟
6.5 从东方公司购入的CMCC工作菌种的管理
CMCC工作菌种斜面购入后进行革兰氏染色、镜检并观察其菌落形态。鉴定合格后将其存放于5℃的冰箱内保存，备用。此工作菌种自购入日后有效期为一个月。一个月后置于121℃高压蒸气灭菌器内进行60分钟的灭菌销毁。
6.6 使用后菌种、菌液、斜面、增菌液及接种用具的的处理
每次复活、传代、使用后的甘油冷冻管、斜面、菌悬液、增菌液等都必须立即置于121℃60分钟灭菌后销毁。
每次接触过菌液的接种环都必须于火焰上过火灭菌。
购入的菌种的内外包装都必须于121℃60分钟灭菌后销毁。
6.7 菌种传代时培养基的选择
大肠杆菌 ：营养肉汤（NB）或营养琼脂培养基(NA)
铜绿假单胞菌：营养肉汤（NB）或营养琼脂培养基(NA) 沙门菌：营养肉汤（NB）或营养琼脂培养基(NA) 金黄色葡萄球菌：酪蛋白胨琼脂培养基（SCDA） 白色念珠菌：酵母、霉菌琼脂培养基（YMA） 枯草芽孢杆菌：营养琼脂培养基(NA)
黑曲酶菌：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
6.8 菌种的使用及传代记录的填写
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6.8.1 菌种传代后用于鉴定的革兰氏染色镜检照片归档保存，并给出号码。号
码由日期和菌种名称构成。如：2003/10/28（大肠杆菌）
6.8.2 菌种使用及传代人根据操作的具体使用情况记录于相应的记录栏内。
6.8.3 如为菌种传代则填写“传代日期、菌种检查结果、操作者、菌种 处理”等项目。在“样品信息”一栏内填写传代代数及传代数量。
并在“备注”栏内填写革兰氏染色镜检照片的序列号。其它无需填写栏目则以（－）表示。
6.8.3 如为菌种使用则须填写此次使用菌种的“传代日期、操作者、使用日期
、使用人、使用后菌种处理、样品信息”等项目。在“备注”栏内填写剩余数量。其它无需填写栏目则以（－）表示。
6.8.4 如为购入菌种的第一次传代使用，则还要在“备注”栏内填写购入批号、
日期等信息。
大肠杆菌菌种的使用与传代记录表
例：
传代日期 操作者 使用日期 使用人 使用后菌种处理 121℃60′灭菌 月末确认 样品信息 第三代传代用于菌种冷冻管 备注 2003/10/24购入ATCC8739 2003/10/25(大肠杆菌) 剩余3支 菌种检查 菌落形态 G染色 无芽孢、短小杆菌 阴性 10/25 李志珍 － 10/27 － 李志珍 10/25 － － 李志珍 121℃60′灭菌 空胶囊03001阳性对照 6.9 菌种管理台帐的填写
6.9.1 每次购入菌种都应在“菌种管理台帐”内填写“菌种名称、菌种类型、
批号、规格、购入日期、有效期限、库存量”。其中“规格”栏填写包装 规格（如10支/罐）。“菌种类型”栏内填写“ATCC菌种或CMCC工作菌种或标准菌种”。“库存量”栏内填写“剩余的最小包装数量（如ATCC第三代菌种的最小包装为环即填写剩余几环”。
6.9.2 每次购入菌种使用时也应填写“菌种管理台帐”。除填写6.9.1包括的
内容以外还需填写“使用日期”及“使用后库存量”。
例： 菌 种 管 理 台 帐 菌种名称 菌种类型 批号 规格 购入日期 有效期限 使用日期 库存量 备注 FD-002/0
上海11制药 标 题 标准菌种的管理与传代程序 大肠杆菌 ATCC8739第三代工作菌种 ATCC8739第三代工作菌种 605761 10环/罐 2003/10/25 有限公司 :SMB004 : : 3 :共 10 页 10环 文件号码 发行日期 版本号码 第 8 页 2004/07/31 － 2003/10/25 － － 大肠杆菌 605761 10环/罐 2003/10/25 2004/07/31 9环
7.0 注意事项
7.1 大肠杆菌斜面培养时间不易过长，一般不易超过24小时，如果超过24小时
8
所制成的原液就超过10个／ml菌悬液，而影响最终的检验结果。
7.2 一般每支冻结的标准菌种能传代五次，从第三代开始使用，每代使用1个月，
3个月后应进行更换冷冻管。
7.3 每代进行接种培养后要先进行革兰氏染色、镜检，确保菌种在传代过程中
没有发生菌种的变异。只有在革兰氏染色、镜检结束后以确定菌种没有发 生变异的情况下，此菌种才可使用。
大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌、沙门菌为革兰氏阴性菌、铜绿假单胞菌为 革兰氏无芽孢阴性杆菌、金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌、枯草芽孢杆 菌镜检有芽孢、白色念珠菌的死细胞染色后为蓝色，活细胞染色后无色。 （染色液为0.1%亚甲蓝液）
7.4 保藏细菌的培养基应无糖，其他菌类含糖小于2％为宜，以免产酸过多，影
响菌种的存活。
7.5 铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。我们使
用此法保存是因为我们每次进行传代时都要进行增菌培养后，再进行接 种。（菌种的增菌培养即菌种的激活过程。）
7.6 存放菌种的5℃的冰箱和－80℃的冰箱分别是带锁冰箱。每次取用后必须加
锁。每天查看冰箱温度并做记录。
8.0 培养基的配制
营养琼脂培养基 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉膏粉 3.0g
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上海11制药有限公司 标 题 文件号码 发行日期 标准菌种的管理与传代程序 版本号码 第 9 页 琼脂 13.0g 纯化水 1000ml 121℃灭菌15分钟 灭菌后pH： 7.2～7.4
营养肉汤培养基
胨蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g
牛肉膏粉 3.0g 纯化水 1000ml 116℃灭菌20分钟 灭菌后pH： 7.2～7.4
酪蛋白胨琼脂培养基(SCDA) 酪蛋白胨 15.0g 大豆蛋白胨 5.0g NaCl 5.0g 琼脂 15.0g 纯化水 1000ml 121℃灭菌15分钟 灭菌后pH值：7.3±0.2
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） 马铃薯汁 4.0g 葡萄糖 20.0g 琼脂 15.0g 纯化水 1000ml 121℃灭菌15分钟。 灭菌后pH值：5.6±0.2
酵母、霉菌琼脂培养基 酵母汁 3.0g 麦芽汁 3.0g 蛋白胨 5.0g 葡萄糖 10.0g 琼脂 20.0g 纯化水 1000ml 121℃灭菌15分钟
:SMB004 : : 3 :共 10 页 FD-002/0 上海11制药 标 题 标准菌种的管理与传代程序 有限公司 :SMB004 : : 3 :共 10 页 文件号码 发行日期 版本号码 第 10 页 灭菌后pH值：6.2±0.2
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