新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及鉴定

胞的临床应用。 4.3 基因治疗

由于神经干细胞可在体外培养和修饰，有利于进行遗传修复，神经干细胞应用于基因治疗有如下特点：①具有自我更新能力并可在培养中增殖；②易于表达外源性基因，神经干细胞可在体外根据不同需要导入相应的外源基因，成为细胞载体；③可形成单一克隆；④在体内不易改变其干细胞特性；⑤移植后可以定向迁移到受损部位。

我们应该清醒地看到，虽然神经干细胞的发现具有划时代意义，神经干细胞研究的一些成果也是令人鼓舞的，但神经干细胞的应用不仅取决于神经干细胞本身，更取决于相应的伦理学与法律问题，我们应该用科学的、理性的态度去评价神经干细胞的研究及应用。但无论如何，神经干细胞的发现对人类健康的意义是积极的。虽然神经干细胞应用于临床还有许多问题需要解决，但我们相信，随着干细胞特性、分化、移殖等方面研究的日益深入，神经干细胞在神经疾病治

黑龙江医药科学 2002年10月第25卷第5期

疗方面将有广阔的前景。

参考文献

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(2002-09-13收稿)

作者简介：朱晓峰(1963~)男,山东蓬莱人,1995年毕业于同济医科大学,教授,硕士研究生导师,博士后。

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及鉴定*

徐忠烨 朱晓峰

（佳木斯大学神经科学研究所）　

提要 目的：从新生大鼠海马分离培养并鉴定神经干细胞。方法：应用含有碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）和表皮生长因子（ＥＧＦ）的无血清条件培养基，采用无底物的悬浮培养法培养神经干细胞，并用免疫细胞化学技术鉴定传代后形成的细胞团。结果：ＥＧＦ＋ｂＦＧＦ可以明显地促进神经干细胞增殖，免疫细胞化学检测发现传代后形成的细胞团中的细胞均表达神经上皮干细胞蛋白（Ｎｅｓｔｉｎ）。结论：我们成功地建立了新生大鼠海马神经干细胞培养模型。　

关键词 海马；神经干细胞；培养

中图分类号 R329.2+8 文献标识码 A 文章编号 1008-0104(2002)05-0002-03 自1992年Reynolds等首先从成年大鼠纹状体分离培养40ng/mL，bFGF40ng/mL，EGF+bFGF各20ng/mL)，另外三出神经干细胞以来，神经干细胞的基础及应用研究已成为神种为含2%B27的无血清条件培养基(细胞因子含量同上)。经科学领域研究的热点。神经干细胞因其具有自我更新和向37℃，5%CO2条件下培养7d，每3天换液1/2。 神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的能力，因此在1.3.2 传代培养 移植治疗中枢神经系统损伤和退行性疾病上具有广阔的应将原代培养7d的细胞团移入青霉素小瓶中，用尖头抛用前景，同时也为研究中枢神经系统的发育提供了一个良好光的吸管反复吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色计数后以的模型。研究表明神经干细胞存在于胚胎和成年哺乳动物中5×104个/mL的密度接种于25cm2的培养瓶中，分别加入含枢神经系统的多个区域，表达特异性的抗原标记Nestin，体bFGF+EGF 20ng/mL、1%N2和bFGF+EGF 20ng/mL和外培养时在EGF，bFGF等丝裂原作用下可以不断地增2%B27的条件培养基，每7天机械分离传代一次，方法同前。 [1,2]

殖。本实验旨在建立起新生大鼠海马神经干细胞的培养1.3.3 Ｎｅｓｔｉｎ免疫细胞化学　模型，为进一步研究神经干细胞的分化和特性以及临床应用将二次传代后的细胞团滴在涂布有多聚赖氨酸的盖玻奠定基础。 片上，加入含有EGF20ng/mL和2%B27的条件培养基以维1 材料和方法 持其存活，贴壁培养12h后进行Nestin免疫细胞化学鉴定，1.1 实验动物 Nestin的染色方法根据试剂盒提供的方法进行，Nestin的使

新生24小时内的Wistar大鼠，由佳木斯大学实验动物用浓度为1：1000。 中心提供 2 结果 1.2 试剂及药品 2.1 原代培养观察

Neurobasal 培养基(DMEM/F12 1：1)、N2添加剂、B27接种6h观察，各组中均有较多悬浮物存在，相差镜下添加剂、Hank’s液(GIBCO公司产品)，谷氨酰胺(Sigma公观察，在悬浮物中有大量的单个圆形细胞及由数个细胞聚集司产品)，Poly-L-Lysine、免疫组化试剂盒(购于北京中山生在一起形成的小型细胞团。原代培养2~3d后，在B27组中物技术有限公司)，人类重组EGF、bFGF、Nestin一抗(购于一些悬浮生长的单个细胞开始发生，而N2组中未发现北京晶美公司)。 此现象。原代培养6d后，镜下观察视野清晰，已无接种时1.3 实验方法 的细胞碎屑，在各组中均有大小不一、数量不等悬浮生长的1.3.1 取材 细胞团，其中在bFGF组中，仅有少量小型细胞团形成，而

常规分离新生大鼠海马组织，Hank’s液漂洗三遍后，剪在EGF组中有较多的大中型细胞团形成，但是形成的细胞碎成糊状，加入神经元基础培养基，用尖头抛光的长颈吸管团在大小和数量上不及bFGF+EGF组。其中较小的细胞团

5

反复吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色计数后以5×10个/mL由数个至数十个细胞构成，而较大的细胞团由上百个甚至数的密度接种于24孔培养板中，再分别加入6组不同的条件百个细胞构成，并且开始出现一些细胞团相互融合成一个更培养基，三种为含1%N2的无血清条件培养基(EGF 大的细胞团现象。相差镜下观察，细胞团中的细胞境界清楚，

HEILONGJIANG MEDICINE AND PHARMACY Oct. 2002, Vol. 25 No. 5 ・3・

折光性好，在bFGF+EGF组中的细胞排列比其它组更为致密。细胞团贴壁分化后的形态各组也有所不同，在bFGF和bFGF+EGF组中大量的细胞呈放射状由细胞团中迁移出来，分化的细胞形态不规则，胞体多呈圆形或不规则的多边形，突起短且少无明显的分支，不具备明显的神经元或胶质细胞形态(图1)。而在EGF组中，细胞在细胞团周围展开呈扁平状，细胞形态立体感差，细胞胞体多呈锥体型，突起较长且较粗，细胞胞体之间紧密排列。在N2组中细胞团形成的数量较B27组少。

2.2 传代培养细胞观察

接种后镜下观察在培养液中有大量单个悬浮生长的细 图1 无底物贴壁的细胞团 相差250×

图3 传代6天的神经干细胞团 相差250× 3 讨论

神经干细胞是一种高度未分化的细胞，它符合干细胞的基本特性：①可持续增殖；②可以自我更新；③产生的大量子代细胞中有相应的前体细胞；④终生具有多分化潜能；⑤

在组织发生损伤或病变后可以产生相应的新细胞[3]

。这就打破了中枢神经系统内没有新生神经细胞的传统观念，为在体外研究多种因素在中枢神经系统发育中的作用提供了一个良好的研究模型，同时因神经干细胞具有多分化潜能、迁移能力强、免疫原性低、可稳定的表达外源性基因等特点，为治疗中枢神经系统损伤和退行性疾病提供了一条新的思路[4]。

本实验取材对象为新生24小时内的大鼠海马组织，除因为海马是中枢神经系统内主要的神经干细胞聚集区外[5]，海马在中枢神经系统内的境界相对清晰，便于取材而不至于将其他部位的神经干细胞混进来。在促进神经干细胞方面，EGF、bFGF是两种最常用的丝裂原，我们在实验中体会到，在扩增神经干细胞方面，bFGF+EGF的作用明显强于EGF，而EGF的作用又明显强于bFGF。原因可能是新生大鼠海马表达EGFR的神经干细胞多于表达FGFR的神经干细胞，或是EGF对海马神经干细胞的作用明显强于bFGF的作用。另外有文献报道EGF可以促进神经干细胞进行对称胞，也有少量由4~8细胞构成的小型细胞团存在。在B27组中，传代2~3d后，细胞开始(图2)，6d后形成一些大型的细胞团(图3)，神经干细胞形成细胞团的比例大约是90%；而在N2组中培养6d后出现明显的细胞团，细胞团形成率约为70%。传代后形成的细胞团与原代的细胞团相比不易贴壁分化，只有体积大或发生细胞团融合时才贴壁分化，分化的细胞形态与原代培养中bFGF+EGF组中的相似。 2.3 免疫细胞化学结果

将传代后形成的细胞团进行免疫细胞化学染色发现，细胞团中的细胞及由细胞团中迁移出来的细胞均表现为胞浆被染色而胞核未被染色的Nestin阳性细胞(图4)。

图2 传代2天的神经干细胞团 相差250×

图4 Nestin染色阳性的神经干细胞 光镜200×

性，产生的子代细胞均可以继续；而bFGF则促进神经干细胞进行非对称性，所产生的子代细胞中仅有一

个细胞可以继续[6]

；而当bFGF与EGF联合应用时，bFGF可以明显加强EGF的作用[7]。综合其他实验室的研究结果可以发现bFGF和EGF对不同部位和不同发育时间的神经干细胞有不同的增殖作用。在成年大鼠脑室下区(SVZ区)，虽然全部的神经干细胞表达FGFR而仅有部分细胞共同表达FGFR和EGFR，但是EGF的作用仍然显著的强于bFGF的作用，说明EGF对此区域的神经干细胞具有显著的增殖作用，而bFGF的作用可能主要在促进细胞进行分化上[6]

；而在胚胎大鼠脊髓神经干细胞中，bFGF的作用明显强于EGF的作用但是不及bFGF+EGF的作用[8]；胚胎14天纹状体神经干细胞仅对bFGF呈反应阳性，对EGF无反应[7]。在时间顺序上，EGF及其受体在胚胎8.5天即有表达，而bFGF及其受体在胚胎11天才有表达[9]。我们的实验结果与上述各有异同，进一步说明不同部位和不同发育时期的神经干细胞在增殖动力学上存在明显差异。使用恰当的神经元基础培养基添加剂对于培养神经元异常重要，对于神经干细胞培养也是如此，1%N2和2%B27是培养神经细胞时最常用的两种添加剂，我们在对比实验中发现，在本实验室条件下，含2%B27的无血清条件培养基可以明显地促进神经干细胞

・4・

的存活，这可能与B27是培养海马神经元时使用的适宜添加剂有关,同时提示各脑区神经干细胞的特性可能存在差异。在培养过程中我们还体会到，神经干细胞与神经元相同对培养液偏酸(pH 6.9~7.2)耐受能力强于偏碱(pH7.4~7.5)，随着培养的时间延长培养液的pH值又逐渐偏碱，故在本实验室条件下可以把培养液的pH值定为7.0~7.2[10]。本实验成功地建立了新生大鼠海马神经干细胞分离培养和鉴定方法，为进一步研究多种细胞因子对神经干细胞的诱导分化作用、神经干细胞表面受体、离子通道、电生理等特性以及神经干细胞在临床治疗中的应用奠定了坚实的基础。

参考文献

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(2002-09-13收稿)

作者简介:徐忠烨(1977~)男,黑龙江大庆人,在读研究生。 *国家自然科学基金资助项目(批准号30170963)

Isolation,culture and identification of neural stem cells from

hippocampus of newborn rats

XU Zhongye ZHU Xiaofeng

(Institute of neuroscience, Jiamusi University Jiamusi 1002, China)

Abstract Objective: To isolation ,culture and identify the neural stem cells from the hippocampus of the newborn rats. Methods: The neural stem cells were isolated from the hippocampus of the newborn rats and cultured by using serum-free medium containing bFGF and EGF without the substrate. After the neural stem cells gave rise to neuropheres,they were mechanically dissociated to single cells,and after the single cells gave rise to neuropheres again which were identified by immunocytochemistry. Result: Neural stem cells isolated from the hippocampus of the newborn rats could be maintained and propagated in the present of EGF and bFGF .The cells in the neuropheres were identified as neural stem cells by immunocytochemistry,because they expressed nestin which is a specific marker of neural stem cells. Conclusion: The culture method of neural stem cells from the hippocampus of the newborn rats was successfully founded.

Key words hippocampus; neural stem cells; culture

BFGF、EGF联合应用对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响*

张晓梅 徐忠烨 朱晓峰

（佳木斯大学神经科学研究所）　

提要 目的：探讨ＥＧＦ和ｂＦＧＦ联合应用后对新生大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响。方法：联合应用ＥＧＦ和ｂＦＧＦ培养海马神经干细胞及诱导贴壁的细胞分化，并用免疫细胞化学技术研究神经干细胞的分化情况。结果：ｂＦＧＦ和ＥＧＦ联合应用可以明显扩增海马神经干细胞，并诱导细胞向神经元和星形胶质细胞分化。结论：ｂＦＧＦ和ＥＧＦ除了具有促神经干细胞有丝作用外，还可以诱导神经干细胞向神经元和星形胶质细胞分化。　

关键词 神经干细胞；分化；ｂＦＧＦ；ＥＧＦ　

中图分类号 R329.2+8 文献标识码 A 文章编号 1008-0104(2002)05-0004-03

Neurobasal 培养基(DMEM/F12 1:1)、Hank’s液(GIBCO神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少

突胶质细胞能力，能自我更新并提供大量神经组织细胞的细公司产品)，谷氨酰胺(Sigma公司产品)，Poly-L-Lysine、

Nestin、GFAP、NSE免疫组化试剂盒(购于北京中山生物技胞。体外培养条件下，在bFGF、EGF等丝裂原作用下可以

[1]

术有限公司)，人类重组EGF、bFGF、Nestin一抗、GFAP通过对称性或非对称性产生大量的子代细胞。bFGF、

一抗、NSE一抗(购自北京晶美公司)。 EGF除了对神经干细胞具有促有丝作用外，对神经干

1.3 细胞培养 细胞的分化也有显著作用。本实验观察了bFGF、EGF联合

应用对体外培养的海马神经干细胞增殖和分化的作用，并对常规分离新生大鼠海马组织，用Hank’s液漂洗三遍后，

剪碎并吹打成单细胞悬液，以5×105个/ml的密度接种于其作用机理进行了初步探讨。

25cm2的培养瓶中，同时加入含bFGF+EGF(各20ng/ml)的神1 材料和方法　

1.1　　动物 经元基础培养液(DMEM/F12 1：1)，37℃，5%CO2条件下培

新生24小时内的Wistar大鼠，由佳木斯大学实验动物养7d，每3天换液1/2。7d后取上清离心5min(1000r/min)，中心提供。 将沉淀物吹打成单细胞悬液后，以5×104个/ml的密度接种

于25cm2的培养瓶中，每7天传代1次，方法同上。 1.2 试剂及药品