交联壳聚糖吸附剂对多肽的吸附性能(1)

材 料 科 学 与 工 艺MATERIALSSCIENCE&TECHNOLOGY

Vol112No13June,2004

交联壳聚糖吸附剂对多肽的吸附性能

张明明,王 虹,刘 韬,付国旗,袁 直,何炳林

(南开大学高分子化学研究所吸附分离功能高分子材料国家重点实验室,天津300071,E-mail:zhiy@nankai.edu.cn)

摘 要:为了研究血液灌流用多肽吸附剂以治疗尿毒症,本文以戊二醛为交联剂,用反向悬浮聚合方法制备了交联壳聚糖吸附剂,继而用NaBH4还原处理,并对其还原效果和溶胀性能作了表征.吸附实验结果表明,吸附剂对选取的六种多肽均有不同程度的吸附;随着多肽链的增长,吸附剂对其的吸附能力体现出先增强后减小的趋势;对分子量为1100的垂体后叶素吸附效果最好.同时,吸附动力学曲线表明,随着肽分子量的增大,达到吸附平衡的时间也延长,对六种肽的吸附分别在016~2h内达到平衡.关键词:尿毒症;中分子;壳聚糖;吸附剂;多肽中图分类号:R318108

文献标识码:A

文章编号:1005-0299(2004)03-0234-04

Adsorptionofpeptidesbycrosslinkedchitosanadsorbent

ZHANGMing-ming,WANGHong,LIUTao,FUGuo-qi,YUANZhi,HEBing-lin

(TheStateKeyLaboratoryofFunctionalPolymerMaterialsforAdsorptionandSeparation;InstituteofPolymerChemistry,

NankaiUniversity,Tianjin300071,China,E-mail:zhiy@nankai.edu.cn)

Abstract:Itisknownthattherearesomemiddlemolecularpeptidesaccumulatedinuremiapatients.blood.Onpurposetocureuremiabyhemoperfusion,theglutaraldehyde-crosslinkedchitosanadsorbentwaspreparedbyre-versed-phasesuspensionpolymerization.AfterreducingwithNaBH4,theadsorbentwasusedinadsorptionexper-imentsforpeptides.Theresultsshowthattheadsorptionabilitydifferswiththedifferentmolecularweightofpep-tides.Thehighestadsorptioncapacityisobtainedwithpituitrin(Mt=1100)withoutadsorptiontendencytoVB12.Alladsorptionsreachequilibriumwithin2h.

Keywords:uremia;middlemolecules;chitosan;adsorbent;peptide 当肾脏受到实质性损伤时,会导致一些代谢产物不能有效外排,不同程度地在血液中积累,从而引起机体一系列病理改变,最终危及到患者的生命[1~9].据报道,在尿毒症患者体内积累的中分子物质中,肽类物质的含量与主要临床症状间存在明显的依赖关系.前期的研究中,也发现在尿毒症患者血内存在分子量为1007的多肽.目前临床上治疗尿毒症主要采用血液透析的方法,这种方法可以有效清除患者体内的水溶性小

收稿日期:2002-10-08.

基金项目:国家基础研究发展规划资助项目(G19990707);国

家自然科学基金资助项目(59873011);教育部跨世纪优秀青年培养计划基金资助项目.

作者简介:张明明(1978-)女,硕士研究生;

袁 直(1961-),女,博士,教授,博士生导师.

[10]

分子毒物,并同时纠正水、电解质及酸碱平衡.但是其对中分子多肽的清除效果不佳,以至于长期

接受透析的患者会产生一系列透析相关并发症.因此,若能研制出多肽吸附剂,就可借助血液灌流的方式,清除过量积累的多肽,维持体液中各种化学成分的平衡和机体内环境的稳定.本文以戊二醛为交联剂制备了球状交联壳聚糖吸附剂,并以此对三肽、四肽胃泌素、五肽胃泌素、垂体后叶素、杆菌肽和促皮质素进行了吸附研究,探讨了吸附剂对中分子肽类模拟物的吸附机理,分析了结构因素对吸附性能的影响.

[11,12]

1 实验方法

111 仪器与试剂

美国Bio-RadFTS135傅立叶红外光谱仪;美国Chncorder-MF-3自动元素分析仪;ShimadzuU-第3期张明明,等:交联壳聚糖吸附剂对多肽的吸附性能

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VPC-2101紫外光谱仪;江苏太仓鹿河生化仪器厂THZ88-1型台式多用恒温振荡器.壳聚糖(食品级),浙江省玉环县玉环化工厂;50%戊二醛,天津津宇精细化工厂;三肽(Wt=511),四肽胃泌素(Wt=697),五肽胃泌素(Wt=786),均购自Sigma公司;垂体后叶素(Mt=1100),天津市生物化学制药厂;杆菌肽(Wt=1450),华美生物工程公司;促皮质素(Mt=4507),上海生物化学制药厂;VB12(Mt=1355)天津市氨基酸公司人民制药厂;其余试剂均为分析纯.112 吸附剂的制备11211 壳聚糖的交联聚合

将少量壳聚糖溶于5%乙酸溶液中.于装有搅拌器及温度计的三口瓶内,依次加入甲苯和少许司班80(约为甲苯溶液体积的1%).待司班80完全溶解后,将壳聚糖溶液倒入三口瓶,开动搅拌,将壳聚糖溶液分散成均匀液珠;再取一定量的50%戊二醛溶液,以恒压滴液漏斗在1h内缓慢滴加入反应体系.将体系升温至50e,维持1h;用碱溶液调pH值至弱碱性,升温到80e,固化4h.得到的吸附剂经水洗、乙醇抽提后,晾干备用.11212 吸附剂的还原处理

将上述壳聚糖吸附剂在碱性介质中用NaBH4

进行充分的还原处理直到无气泡产生为止;处理过的吸附剂颜色由暗黑变为深红,经1mol/LNaCl溶液和蒸馏水反复洗涤后,在湿态下保存备用.吸附剂制备及还原方程式如下:

将已经溶胀平衡的吸附剂由水中取出,抽滤,除净表面的水分后,称量湿态吸附剂重量,记作W1.然后将湿吸附剂真空干燥至恒重,再称量吸附剂重量,记作W2.根据公式计算吸附剂的孔容及含水量.

11314 吸附剂的红外光谱表征

以KBr压片法,用红外光谱仪对未交联壳聚糖、氢化还原前及氢化还原后的交联壳聚糖进行测定与比较.

11315 吸附剂比表面积的测定

通过染料吸附法对溶胀态吸附剂的比表面积进行了测定,具体操作方法如下:

首先配制一系列准确浓度的次甲基蓝溶液,在665nm处测定紫外吸收,做出标准工作曲线.再配制012%次甲基蓝溶液备用.

先在50mL磨口锥形瓶中准确称取湿态壳聚糖吸附剂约1g,再加入20mL012%次甲基蓝溶液,塞上磨口塞,然后放在摇床中吸附过夜.取磨口锥形瓶中的上层清液1mL放入25mL容量瓶中,并稀释至刻度.在665nm处测定溶液吸光度,由标准工作曲线计算浓度.再换算出吸附剂的比表面积.

114 吸附性能研究

配制六种多肽溶液;准确称取少量吸附剂加入其中;以紫外光谱仪,定时测定吸附剂对多肽的吸附;通过吸光度的变化计算吸附剂对各种中分子多肽的吸附量,做出吸附量随时间的变化曲线.

2 结果与讨论

211 吸附剂的表征

21111 元素分析结果

用NaBH4对交联壳聚糖吸附剂中的Schiff碱双键进行了氢化还原处理,并对处理前后的壳聚糖吸附剂做了元素分析测试,以检验氢化还原的效

113 吸附剂的表征

11311 元素分析

吸附剂用蒸馏水洗净,真空干燥24h以上,在Chncorder-MF-3自动元素分析仪上进行元素分析.

11312 吸附剂溶胀性能测试

用量筒量取氢化还原前后的壳聚糖吸附剂敦实后各1mL,加入一定量的水浸泡.待吸附剂充分吸水,达溶胀平衡后,记下吸附剂体积读数,计算体积溶胀率.

11313 吸附剂孔容及含水量的测定吸附剂还原前还原后

果.

表1为还原前后吸附剂的元素分析结果.由于在吸附剂制备过程中加入了过量的戊二醛,因此无法对吸附剂中各个元素含量做出精确的理论计算,但是我们可以清楚地看到还原后壳聚糖吸附剂中的氢含量有所增加,这说明还原反应确实发生了.

表1 元素分析结果

碳含量57137?010157111?0103

氮含量2195?01052157?0101

%

氢含量6191?01037134?0103

#236#材 料 科 学 与 工 艺 第12卷

21112 溶胀性能

由于所制备的吸附剂为凝胶型,而凝胶体系的一个主要特点在于其由干态到湿态转变过程中明显的体积变化,人们对其进行的各种研究、开发、利用也往往是围绕着这一点展开的.对于制备的血液灌流用壳聚糖吸附剂,要在溶胀状态下应用,因此对其溶胀态的研究是必要的.这里我们测试了吸附剂的体积溶胀率、孔容、含水量及比表面积.

吸附剂吸水后体积溶胀率的测试结果见表2.

表2 吸附剂的溶胀率

吸附剂还原前还原后

干态体积/mL

11

湿态体积/mL

23

溶胀率/%

200300

21114 比表面积的测定

溶胀态吸附剂比表面积的测定结果如下:水溶性染料的吸附已应用于测定固体比表

面,在所有染料中次甲基蓝具有最大的吸附倾向.研究表明,在一定的浓度范围内,大多数固体对次甲基蓝的吸附是单分子层吸附,即符合Langmuir吸附模型.

次甲基蓝具有以下矩形平面结构:

根据实验结果推算,在单分子层吸附的情况下,1mg次甲基蓝覆盖的面积可按2145m2计算.

由此方法实验测得氢化还原后壳聚糖吸附剂的比表面积为9715m2/g.212 吸附剂对多肽的吸附

表3为吸附剂对多肽的吸附量.这6种多肽的分子量范围介于511~4507之间,适合作为中分子毒物模拟物.吸附结果显示,吸附剂对六种多肽均产生了一定的吸附作用,其中对分子量为1100的垂体后叶素的吸附效果最明显,达到了271mg/g.从吸附剂和吸附对象的分子结构上来分析,一方面,吸附剂上含有的-OH,-NH2可与肽分子中的O,N原子形成氢键,吸附能力应取决于相互之间作用点位的多少;另一方面,吸附剂的表面形态,网络结构及孔尺寸与多肽间的匹配程度也会对吸附能力造成影响.根据上述观点,分子量较大的多肽(垂体后叶素、杆菌肽、促皮质素)与吸附剂间存在较多的作用点位,它们之间的相互作用也就越强,表现为吸附量较大;但当多肽的分子量增大到一定程度后,促皮质素的体积效应会阻碍其向吸附剂表面和内部充分扩散,因而与吸附剂的结合也变得困难,导致了吸附量有所下降.

表3 吸附剂对多肽的吸附量

多肽三肽四肽胃泌素五肽胃泌素垂体后叶素杆菌肽促皮质素

分子量511697768110014504507

吸附量/mg#g-1

81217195111362711915713104

吸附剂孔容及含水量计算如下:

湿态吸附剂的含水量及孔容可通过下面的公式计算:

含水量X=(W1-W2)/W2@100%

V孔容=(W1-W2)/(Q@W2)

式中:W1为湿态吸附剂重量;W2为干态吸附剂重量;Q为水的密度.

计算得经氢化还原的壳聚糖吸附剂含水量为249%;水的密度为1g/mL,则算得吸附剂的孔容为2149mL/g.

21113红外光谱

图1为未交联壳聚糖(a)、戊二醛交联壳聚糖树脂(c)及经过NaBH4氢化还原处理后的戊二醛交联壳聚糖吸附剂(b)的红外光谱变化图.通过比较可以发现,在大约10nm处(图中箭头所指),未交联壳聚糖没有明显吸收;经过交联处理,在上述位置出现明显的Schiff碱双键的特征吸收;而经NaBH4处理后,双键吸收峰则几乎消失,说明吸附剂中原来存在的Schiff碱双键已转变为稳定的碳氮单键.

a.未交联壳聚糖;b.氢化还原过的戊二醛交联壳聚糖;c.戊二醛交联壳聚糖

同时,选取了一种非肽类物质VB12(Mt=1355)作为吸附对象,考察了吸附剂的吸附选择图1 不同类型壳聚糖的红外光谱图第3期张明明,等:交联壳聚糖吸附剂对多肽的吸附性能

#237#

性,结果显示吸附剂对VB12的吸附量只有0121mg/g,表明对于多肽和非肽物质,吸附剂优先吸附多肽物质,有着良好的吸附选择性.213 吸附过程的动力学曲线

图2所示为吸附过程的动力学曲线.由图2可以看出,吸附剂对所选的6种多肽的吸附作用都在2h以内达到了吸附平衡.其中对3种小分子肽类物质的吸附平衡时间较短,为40~60min;而对分子量较大的3种肽类物质促皮质素则吸附平衡时间较长,为90~120min.对比6条平衡曲线可以发现,达到吸附平衡的时间与吸附对象的分子量大小基本上呈正相关,随多肽分子量的增大,其向吸附剂表面扩散的速度逐渐减慢,因此达到吸附平衡的时间随之加长.

[2]ZIMMERMANL,JZRNVALLH,BERGSTRZMJ,etal.

Characterizationofmiddlecompounds[J].IntJArtifOr-gans(Suppl.),1980,4:33-35.

[3]MABUCHIH,NAKAHASHIH.Middle-sizedpeptidesin

thebloodofpatientswithuremia[J].Nephrol,1983,33:232-237.

[4]MABUCHIH,NAKAHASHIHJ.Profilingofurinarymed-i

umsizedpeptidesinnormalanduremicurinebyhigh-per-formanceliquidchromatography[J].1982,233:107-133.

[5]FLANAGANRWJ,MURPHYRF,BUCHANANKD.

Circulatingformsofglucagonandrelatedpeptidesinnormalsubjectsanduremicpatients[J].BiochemSocTranst,1980,8:426-427.

[6]MATTAEID,LUDWIG-KZLNH,KRAMERP,etal.

Changesofplasmahormonelevelsinhemofiltration[J].IntJArtifOrgans,1983,6:21-24.

[7]储结根,袁直,滕欣莲,等.尿毒症患者血清及正常人

尿液内中分子物质的分离分析[J].中国科学,B辑,2000,30(3):250-255.

[8]VANHOLDERR,DESR,GLORIEUX,etal.Survivalof

hemodialysisPatientsanduremictoxinremoval[J].ArtifOrgans,2003,27(3):218-223.

[9]WILLIAMRC,JAMESFW.Middlemoleculesandsmal-l

molecular-weightproteinsinESRD:propertiesandstrategiesfortheirremoval.AdvRenalReplaceTh,2003,10(4):270-278.

Chromatography,

图2 吸附过程的动力学曲线

[10]CHUJG,YIUANZ,LIUXH,etal.Separationofsix

uremicmiddlemolecularcompoundsbyhighperformanceliquidchromatographyandanalysisbymatrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-o-fflightmassspectrometry[J].ClinChimActa,2001,311(2):95-107.

[11]VADIMD,LUDMILAP,MARIAT,etal.Polymericad-sorbentforremovingtoxicproteinsfrombloodofpatientswithkidneyfailure[J].JChromatogrB,2000,739:73-80.

[12]RONCOC,BRENDOLANA,WINCHESTERJF,etal.

TheNextStepfromHigh-FluxDialysis:ApplicationofSor-bentTechnology[J].BloodPurif,2001,19:260-263.

3 结 论

1)吸附剂具有良好的吸附选择性,对多肽物

质的吸附效果明显好于对非肽物质的吸附;

2)在对多肽进行吸附时,随着多肽分子量的增长,吸附剂对其吸附量体现出先增大后减小的趋势,对分子量1100的垂体后叶素的吸附效果最好,达到了271mg/g;

3)吸附过程的动力学研究表明,吸附剂对6种多肽的吸附在2h内都能够达到平衡,且吸附平衡时间与多肽的分子量基本呈正相关性,多肽分子量越大,吸附平衡时间越长.

(编辑 张积宾)

参考文献:

[1]GIOVANETTIS,BARSOTTIG.Uremicintoxication[J].

Nephron,1975,14:123-133.