采用正交设计和响应曲面设计法优化芦苇随机扩增多态DNA体系

采用正交设计和响应曲面设计法优化芦苇

随机扩增多态<=>体系

?@ABCDEFGH>I[M?\\A]F^FKDE刘金文

沙伟

滕兆岩

b0+c0-d3-1e,f30g3-.he,ij,-齐齐哈尔大学生命科学与工程学院5

黑龙江齐齐哈尔

&;&\"\";6

5l’l’’’&;&\"\";’6ge3b0k3120,-mn-.0-33o0-.piqq3.3r0s0e,3ot-0ur0s0e,3ov30qi-.w0,-.pe0-,

摘要

采用正交设计和响应曲面设计5优化适合于芦苇z随机扩6{|}~!\"#$%&~’&$}~(#&5)6)+x1yp,ugo0-3/4*3+m

增多态y的反应体系’结果确定芦苇x在.冷启动’,-5x-.y6-.y反应体系的最佳方案为7px扩增程序’

反应体系包括模板%(/变性&00’#;/复性%\"4’1!/延伸!00’(\"个循环21!/延伸100’(/保存2!:3---q三磷酸脱氧核苷酸5引物:5\"-461l:00i4l:+4)y,-;.m,g.qg,s酶&0iq

关键词芦苇x-.y正交设计响应曲面设计条件优化中图法分类号r%(#

>[NA\\DaAge3i5*00+0o3,2*0i-4j4*304ikx-.yd3o3i6*,0-3m6jio*ei.i-,qm340.-,-m

|}~!\"#$%&~’&$}~(#&d3o345i-434+ok,23m340.-5x1y6lge3x-.yo3,2*0i-4j4*30ik{o3

l:3’\"1l:m3*3o00-3m7io,!qo3,2*0i-*e3i5*0i-,q2i05i40*0i-0-2q+m3m;-.ik*305q,*3y,-’

’&l:+i:5l00iqikm,g.k*,sy,-’0iqik5o003oge35oi.o,0kio3kk0203-*,05q0k02,*0i-\"2%(/k’#;/kl:00’0-2q+m3m(j2q34ikm3-,*+o,*0i-,*io&00-,--3,q0-.,*io&-,-m3/*3-40i-1!/k!0051006l,*io--kio*e3k0-,q2j2q3|}~!\"#$%&~’&$}~(#&’x’’’8JM9F\\_N{-.yio*ei.i-,qm340.-o345i-434+ok,23m340.-x-.y

i5*00,q

芦苇z{|}~!\"#$%&~’&$}~(#&5l6glp,uo0-3/属禾本科芦苇属’也称普通芦苇’广泛分布于+1*3+m

全国各地的湖泊4浅水洼地4河流沿岸4滨海滩涂和河口等各种生境)长期适应不同地区气候和生境’我国

&+!+的芦苇分化出一些地方变种z用)除了张淑萍z

进行x目的在于得到适合6x1y-.y反应体系优化’

芦苇x为今后研究芦苇遗传变异-.y的扩增条件’奠定基础)

:材料和方法

:l:材料&l&l&芦苇

本试验所用芦苇取自黑龙江扎龙自然

国内关x-.y方法检测黄河下游芦苇的遗传变异外’

于芦苇遗传多样性的研究很少)

随机扩增多态y,-5x,-mi0-05q0k03m

技术是以多聚酶链式反应6.iqj0io5e02y,-’x-.y

为基础’用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链扩56.px增基因组中不同位点的y进而获得等位位点的,-’#+

多态性z构)x-.y技术已被广泛应用于基因定位4建遗传图谱4寻找特定基因连锁标记4研究植物分类

(+和进化以及种群遗传变异性等z本研究以芦苇为研)

保护区)野外采集幼芽’立即放入冰壶中带回试验室’冷藏于;1用于提取y:/中’,-)

三&l&l!试剂引物序列为:$$#’g*gpg***g*磷酸脱氧核苷酸5m,g.g,sy,-聚合酶4<+kk3o和琼脂糖凝胶由北京鼎国生物公司提供)

紫外凝胶&l&l#仪器.$(8\"’px仪为德国产.n

成像系统t=.$8\"\"\"):l>方法&l!l&模板y,-的提取

取\"加入少许抗坏血酸钠和?l#.芦苇嫩芽’$在液氮中迅速研磨成细粉末状’迅速移入&’l:@n

’l&&,il!’\"\"(*+,-./01203-234=iq@,j!

究对象’在正交设计结果的基础上’进一步应用统计学方法中的响应曲面设计5’x345i-431+ok,23y340.-!\"\"#$\"%$&!收稿’!\"\"($\"&$!%修回)

万方数据&(8

立即加入/预热012!\"的#$$%&’()*+,-%中.\"

的7每隔341515水浴保温<1!=.:提取液;&冷却至室温后.加入等体积的7>?0!=@&轻轻混匀;

提取液.颠倒混匀A缓1!=.A1111).&$!离心B!=&慢吸取上清液到一新的#中;重复7$$%&’()*+,-%@抽提C直至界面无蛋白质沉淀出现;上清液中?>次.

混匀.可见絮状沉淀.用加入CD0倍体积的无水乙醇.玻璃棒挑取.用/0E的乙醇溶解沉淀与一新的

中;用/室0E的乙醇漂洗F#$$%&’()*+,-%G9C次.温下风干.溶于A的无菌水中备用;112\"

ADCDC反应体系的组成及扩增条件

CK

经改02;扩增条件J3H9IF的反应总体积为C\"

良6冷启动MLN<5变性A!=.>45复性N1O./C5延&伸C!=.<1个循环M/C5延伸/!=<5保&&A个循环M

0

主因素;采用Y正交表.设计<因素<水平3表3<6A4

的正交试验.共设A每组重复C次.A个处理组合.

先找到适合芦苇H9IF反应所要求的各个因素的范围;

^

表Z[正交设计各因素的水平设计3]6Z\\

^3]6Z\\_‘abcZdcecfghi‘ehjijkbclcbmkfjgc‘nok‘nejfhi[

jfeojpji‘bqcmhpi

模板FG9水平数

8%!$\"W+%FG9

Y%r%\"

36&UA

C>8WX$(\"s!%)WO%I)=!%)

3C,Q63A1IQ63A1T!62\"!(\"2\"’G8I1DC0

1D01D/0A1DC1D>1D01D/1DC0

1D01D/0A注L模板浓度为C体系的总含量;G(02L\"+%8S%R(&R%&+)W+=(&(*%r%)s0*WR+()=O=&C2\")%WR+=(&OsO+%!t

存;扩增产物于AD0E琼脂糖凝胶电泳.>PQ>S.R!.

紫外凝胶成像系统观察并照相分析;#:染色.

ADCD>H9IF反应体系优化的正交设计

CV

由于我们所用的:内含TU因此其它的.,**%)模板F<个因素L.G9.’G8I8WX酶和引物为试验的

表v]因素w水平响应曲面设计

ADCD基于正交设计的结果.进一步应用统计学方法中的响应曲面设计.采用<因素>水平的HuF进行H9IF反应体系优化;应用u9u软件计算出响应曲面设计通用表;表C列出响应曲面设计的C/组组合的各因素浓度;

_‘abcvdcecfghi‘ehjijkeofccbclcbmkfjgkjxfk‘nejfmhifcmyjimcmxfk‘ncqcmhpi反应因素H%O$(&O%*WR+()模板FG9

68%!$\"W+%FG93&U’G8I

3!QT68WX酶

3CQ68WX$(\"s!%)WO%,2\"

引物I)=!%)3A1Q6I!(\"2\"反应因素H%O$(&O%*WR+()

反应因素的浓度H%O$(&O%*WR+()R(&R%&+)W+=(&

AC1/D01D>

C41A11D>

>C101D0

<41A11D0

041A11D/

441/D01D/

/A11/D01D0

BC1A11D0

NA11/D01D/

A1A11/D01D>

AAA11/D01D0

AC41/D01D>

A>C1/D01D01D0

1D/01D/01D/01D01D/0AD11D/01D/01D/01D/01D/01D0

H%O$(&O%*WR+()R(&R%&+)W+=(&C1C1/D01D0AD1

C14101D0

CC4101D/

C>A11/D01D/

zzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzz反应因素的浓度

A<41/D01D0

A0A11/D01D0

A441/D01D>AD1

A/41/D01D/

AB4101D>

AN41A11D0

CC04101D0

C441/D01D0

C/41A11D0

模板FG9

68%!$\"W+%FG93&U’G8I

3!QT68WX酶

3CQ68WX$(\"s!%)WO%,2\"

引物

3A1Q6I)=!%)I!(\"2\"

1D/0AD11D01D/0AD1AD11D/01D/01D/01D01D/01D/0

注L模板浓度为C体系的总含量;G(02L0\"+%8S%R(&R%&+)W+=(&(*%r%)s*WR+()=O=&C2\")%WR+=(&OsO+%!t

v结果和分析

vDZ{|}d反应体系优化的正交设计从图A中可以看到.在正交设计的A4组中出现条带的组合有第>其他各组合没~<~/~B~N~A1组合.有出现条带;同时在C的H02\"9IF反应体系中模板

说明C1&FG9的浓度为AU的各组合中均没有条带.在C芦苇H02\"9IF反应体系中最高模板浓度不能高万方数据广西科学

C11<年0月

第AA卷第C期

于AC1&;一般认为HU9IF的模板浓度在一定范围

!A

内3并不会影响扩增条带的增1D无延伸反应.扩增产物链化.电泳后染’G8I消耗完.

BK

色强度低.出现扩增效果差的现象J;模板浓度直接影响扩增产物的再现性.特异性和产量.过量的模板

NK会增加错配的机会.从而增加非特异性的程度J;浓

A度过高!影响了产物的再现性!这可能是过高的模板浓度没有出现条带的原因\"因此在#体系’($%的&)中模板%--.\"03*+的最高浓度设为,/*12145酶3引物的范围适合与芦苇的#+2%的反应体系\"676:;反应体系优化的响应曲面设计图&的#在#=组设计中+2%结果显示<$%的&除了,其余的各组3,>和&=组合中没有出现条带外!

均出现了?@A条清晰的条带\"#+2%反应体系是各

组分协同作用的结果!第,3,>3&=组合中没有出现条带的可能的原因是复杂的!很难确定!需要在以后的研究中进一步探索\"说明适合芦苇#+2%体系的各因素的范围还是较大的\"其中第,=个组合的条带数最多!而且清晰\"它的各因素水平为模板%-3*+>./

引物’BF=7’BC37’DE3E\"())()0*12145酶,

图,正交设计的#共,&个加样孔为一个组合!>组H+2%结果G

7,#G>RHIJ/+2%KLMD)NMOKFBFKNPF/F.4)0LMJ/.1PLNQF)4.LJMF.LRFBSJ.4NJF.4.04))JM,FBSJ.4NJF.M

图&响应曲面设计的#,@&=为组合数H+2%结果G

7&#GHIJ/+2%KLMD)NMOKFBKLMTF.MLMDKO4RL0LMJ/.1PL.DBSLKKLTKLML.NMRFBSJ.4NJF.M

67U:;反应体系的稳定性

第,得=个组合用,>个不同的引物重复,>次!到的#图?3V3’3>是V个引物的+2%结果均较好G显示#!#+2%图谱H$%优化反应体系具有良好的稳定性\"

图’引物W,扩增芦苇的#2%+2%图谱X’#,TIJ/+2%TKFOLMMFOKLL0SYW2%KJBLK

图?引物W2+V扩增芦苇的#+2%图谱

X?#IJ/+2%TKFOLMMFOKLL0SYW2+VTKJBLK

图>引物W,&扩增芦苇的#22+2%图谱

X>#,&TIJ/+2%TKFOLMMFOKLL0SYW22KJBLK

U讨论

简便3通用好3对#+2%遗传标记技术具有快速3

,-[

质量要求低等优点Z一经问世!%*+的需求量小3

就受到广泛的关注\"但在某些方面由于稳定性和可重

下转第,G>-页\\>-HF.NJ.DLF.T4/L,

!7,,*F7&!--V]D4./^J$RJL.RLM_F)C4Y&

图V引物W,扩增芦苇的#2+,+2%图谱XV#,TIJ/+2%TKFOLMMFOKLL0SYW2+,KJBLK万方数据,’-

性的指示者!

蝗虫群落多样性指数从低海拔到高海拔依次降低\"以海拔#$$%&$$’区域最高()*$+,-&./而海拔在0-$$%01$$’区域最低()*$+22#.!这主要是因为在低海拔处气候温暖湿润\"植被类型多样\"随着海拔增加\"气温逐渐降低\"植被类型也相对单一\"故多样性指数逐渐下降!可能由于一些适于较高海拔的蝗虫存在\"在中海拔区域物种数反而高于低海拔区域\"但其均匀度($+1#3.与后者($+2#$.有较大的差距\"致使多样性指数相对较低!海拔0-$$%01$$’区域的物种数远低于中4低海拔区域的物种数\"以致指数最低!其优势种与中海拔区域的基本相同!值得注意的是在01$$’以上没有调查到任何蝗虫物种\"这可能是该区域的年均温太低\"达不到蝗虫生长发育所需的有效积温\"从而了蝗虫在该区的分布!在#个月份中\"蝗虫群落多样性从低到高依次为52月(月()*$+121.40$月()*$+&2,.4&)月(*$+,61.4,)*$+,#0.\"&月份蝗虫的物种数虽高于,月份\"但由于其均匀度($+1#2.不及,月份上接第0(3$页?3$.一般的均(0.\\@8]体系的优化的方法有多种\"

00%06_

采用多次单因素设计的方法^但由于单因素客\"

($+1&-.\"故多样性反而比后者低\"反映出其群落结

构还未达到稳定!

参考文献

蝗虫分类学7西安5陕西师范大学出版社\"0郑70,,67尤其儆\"蒲天胜\"等7广西昆虫名录7南宁5广西科-张永强\"

学技术出版社\"0,,#702%-17

郑7广西蝗虫7桂林5广西师范大学出版社\"6蒋国芳\"

0,,&7

郑7广西苗儿山自然保护区蝗虫二新种7昆虫#傅鹏\"

分类学报\"-$$-\"-#(0.5-0%-17马克平主编7生物多样性研究的原理与方法7北3钱迎倩\"京5中国科学技术出版社\"0,,#718779:;<=>?@A9ABC5\"0,1,7L杨龙龙7西双版纳热带雨林环境变化对蝗虫区系2黄春梅\"

成分和物种多样性的影响7生物多样性\"0,,&\"1(-.50--%0607&

7V\"YZ5VO9;;9F’R\"0,&07YA9[:CR9BI8C:RR

责任编辑5邓大玉.(

析7草业学报\"0,,&\"2(-.50%,7

芦苇分子生态学研究(博士学位论文.哈尔滨5东-张淑萍77

北林业大学\"-$$07#76O:\";RGNSE?;:;;FADS7d9AH:CUC9AB9AH7X宿兵7遗传多样性研究的原理和方法7杭州5浙#季维智\"

江科学技术出版社\"0,,,7-3%-27邹喻萍\"尹蓁\"等7矮牡丹与紫特丹\\3裴颜龙\"@8]分析初报7植物分类学报\"0,,3\"66(#.563$%6317董伟\"张志永\"等7大豆\\1邹继军\"@8]影响因素的探讨7大豆科学\"0,,&\"02(6.50,2%-$07水稻幼苗单株]2李晋涛7f@J的提取及其8?\\\\@8]反应

生物技术\"体系的建立70,,&\"&(#.506%017李松涛\"王斌7&张忠廷\"\\@8]在水稻温敏核不育研究的

遗传学报\"应用70,,#\"-0(3.5626%62&7,?O迪芬\"eQeQ德维克斯勒78?\\技术实验指南7北京5科学出版社\"-$$-7葛颂\"王晓东7系统与进化植物中的分子标记70$邹喻革\"北京5科学出版社\"-$$07#0%#37宋林生7栉孔扇贝\\内蒙00朱玲\"@8]反应体系的优化7

自然科学版.古民族大学学报(\"-$$-\"02(6.5-6#%-617阮颖\"官春云\"等7油菜\\0-刘春林\"@8]反应体系的优

湖南农业大学学报(自然科学版.化研究7\"-$$0\"-2(1.5#6-%#667

韩冰\"张红梅\"等7针茅属植物\\06赵萌莉\"@8]条件优

化7干旱区资源与环境\"-$$6\"02(0.5,1%,,7王全立\"胡良平\"等7随机扩增多态性]0#叶明亮\"J@反应体系优化设计方案的比较7中华检验医学杂志\"-$$0\"-#5

6#-%6#37

这是影响\\观地存在多因素交互作用的影响\"@8]

反应稳定性的主要因素!正交设计是从复因子实验的结果中\"挑选几个处理进行实验\"得到代表性的结果!本文先采用了正交设计方法确定了\\@8]各因素的

正交设计相对与单因素设计减少了许多的处理范围!

组合\"从而节省了许多的人力和物力!

自变量.通过合(-.\\Q]是将若干个实验因素(

理的实验设计来科学地安排各因素水平的组合\"以确使反应变量取得最佳的效定各实验因素取值的趋向\"

0#_果^从稳定性性和!它完全克服了交互作用的影响\"

工作量来看\"科学4\\Q]比多次单因素设计更简易4合理!

在正交设计和\\(6.Q]的基础上得出了芦苇

反应体系包括5模板3‘;\\@8]最佳反应体系!-引物3$A42+3’S4+3=4]J@1HDJa8aFb酶0循环参数为5冷启动//,#c变性0’9\"61c复‘’<;A

性,$R\"2-c延伸-’9\"#$个循环/2-c延伸2’9AA0个循环/#c保存!

参考文献

郎惠卿7不同生态条件下芦苇无性系种群调节分0杨允菲\"万方数据责任编辑5邓大玉.(

\"+00J<+-\"$$#e=FAHW9QE9:AE:Rg<;SFI-

01$