肺炎链球菌分型技术-多位点序列分型 MLST Typing

肺炎链球菌相关实验技术操作手册

多位点序列分型

（Multi Locus Sequence Typing）

试验开始前，请准备：

冰浴。扩增体系配制及样品添加过程需在冰浴上操作。

将冷冻保存的试剂取出，室温放置融化后冰浴上备用；Taq酶直接放置在冰浴上。 1.5%琼脂糖凝胶（含DNA染料4µl/100ml）。 试验步骤：

1. 待测样品的DNA制备；冷冻保存的DNA室温下自然融化后，冰浴放置备用。 2. 扩增体系配置（50µl/reaction）：

成分名称

体积（µl）

10Xbuffer（含MgCl2） 5

dNTP（10mM） 1 Primer F（20µM） 0.5 Primer R（20µM） 0.5 Taq（5U/µl） 1

DNA 5 H2O 37

3. 扩增条件：

步骤

温度

时间

预变性 94℃ 3min 循环-1 94℃ 30s 循环-2 56℃ 30s 循环-3 72℃ 30s 30个循环

延伸 72℃ 5min 保存

4℃

本手册仅供实验室内部使用 2011年第1版

中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所呼吸道传染病室

肺炎链球菌相关实验技术操作手册

4. 扩增产物验证：将扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶（含DNA染料4µl/100ml），100V，电泳40min；片段长度600-800bp。

5. 产物纯化后，连同相应的测序引物送交测序公司测序（每个样品配5µl上、下游测序引物，引物浓度10µM）。

6. 得到序列信息后，递交到相关网站进行序列比对，确定ST， http://spneumoniae.mlst.net/sql/singlelocus.asp；将分型结果及时添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。

Reference

*http://spneumoniae.mlst.net/misc/info.asp

本手册仅供实验室内部使用 2011年第1版