(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112390874 A(43)申请公布日 2021.02.23
(21)申请号 202011214042.7(22)申请日 2020.11.04
(71)申请人 东南大学
地址 210000 江苏省南京市玄武区新街口
街道四牌楼2号(72)发明人 任巧云 刘安 党睿 谢维 (74)专利代理机构 北京同辉知识产权代理事务
所(普通合伙) 11357
代理人 王依(51)Int.Cl.
C07K 14/705(2006.01)C07K 1/04(2006.01)C07K 1/06(2006.01)C12N 15/12(2006.01)A61K 38/17(2006.01)
(54)发明名称
一种合成多肽及其合成方法和应用(57)摘要
本发明公开一种合成多肽及其合成方法和应用，该合成多肽的具体氨基酸序列为：酪氨酸‑甘氨酸‑精氨酸‑赖氨酸‑赖氨酸‑精氨酸‑精氨酸‑谷氨酰胺‑‑精氨酸‑精氨酸‑精氨酸‑谷氨酸‑缬氨酸‑赖氨酸‑异亮氨酸(YGRKKRRQRRREVKI)。其是以异亮氨酸作为第一个氨基酸，将其‑NH2裸露，然后与第二个氨基酸‑赖氨酸的‑COOH缩合，形成酰胺键，照此依次连接其余氨基酸，最后连接酪氨酸，即得所述合成多肽。该合成多肽能有效改善寡聚体造成的突触抑制现象，并无其他异常反应；其功能区域为内源性蛋白上的一段序列，几乎不会引起细胞的排斥反应，且其本质是一段氨基酸序列，便于降解，而不会造成身体器官的负荷。
A61P 25/28(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图2页
CN 112390874 ACN 112390874 A
权 利 要 求 书
1/1页
1.一种合成多肽，其特征在于，包括一段能够选择性地破坏AMPAR亚基GluA2与蛋白激酶C相互作用蛋白1结合的功能性多肽序列，所述功能性多肽序列为AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列的相似序列，所述AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述功能性多肽序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的相似度大于60％。
2.根据权利要求1所述的合成多肽，其特征在于，所述功能性多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的合成多肽，其特征在于，还包括能够穿透细胞膜的一段多肽序列，所述合成多肽由所述功能性多肽序列和能够穿透细胞膜的一段多肽序列重组获得。
4.根据权利要求3所述的合成多肽，其特征在于，能够穿透细胞膜的一段多肽序列选自人类免疫缺陷病毒的部分氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的合成多肽，其特征在于，所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求1、2、4或5所述的合成多肽，其特征在于，所述合成多肽为直链结构。7.编码权利要求1、2、4或5所述的合成多肽的基因。
8.权利要求1-7任意一项所述的合成多肽在制备预防或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
9.权利要求1-7任意一项所述的合成多肽的合成方法，其特征在于，以树脂作为合成多肽合成的载体，以异亮氨酸作为第一个连接到树脂上的氨基酸，按照SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列逐一将上一氨基酸的-NH2与第二个氨基酸赖氨酸的-COOH缩合，然后将合成多肽自树脂上脱除获得合成多肽粗制品，粗制品纯化后即获得所述合成多肽。
10.根据权利要求9所述的合成多肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：a.将第一个氨基酸(异亮氨酸)的-COOH用N,N-二异丙基乙胺连接到Cl树脂上，然后将树脂上未反应完的功能团用甲醇封闭；
b.用DMF洗涤；
c.用哌啶去除第一个氨基酸中-NH2的保护基团9-芴甲氧羰基，使-NH2裸露；d.用DMF洗涤；
e.将第二个氨基酸(赖氨酸)的-COOH用N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑活化，然后缩合至第一个氨基酸中的-NH2上，形成酰胺键；
f.用DMF洗涤；
g.用哌啶去除第二个氨基酸中-NH2的保护基团9-芴甲氧羰基，使-NH2裸露；h.用DMF洗涤；
i.重复步骤e-h直到最后一个氨基酸(酪氨酸)的-NH2裸露；j.加入切割试剂，将多肽从树脂上切割，并切除所有氨基酸的侧链保护基团，得切割液；
k.将切割液加入乙醚中，使多肽沉淀，离心即得到多肽粗品，粗制品纯化后即获得所述合成多肽。
2
CN 112390874 A
说 明 书
一种合成多肽及其合成方法和应用
1/6页
技术领域
[0001]本发明属于多肽及其合成的技术领域，具体地说涉及一种合成多肽及其合成方法和应用。
背景技术
[0002]阿尔茨海默症(AD)即俗称的老年痴呆症的一种，是一种神经退行性脑部疾病，潜隐起病，病程缓慢且不可逆，其临床表现为记忆减退、认知障碍、人格改变、语言障碍等，早期病理特征是大脑中β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常沉积。阿尔兹海默症是全球影响最广的神经退行性疾病之一。根据《2019年世界阿尔茨海默病报告》的数据，全世界约有5000万人患有阿尔茨海默病，预计到2050年这一数字将增加到1.52亿，而该病症全球每年的经济负担估计约为1万亿美元。AD的病因众说纷纭，但是其中不可否认的是，种种病因都可能导致突触结构以及功能受损，表现为LTD的过度易化以及LTP的异常抑制以及树突棘的丢失，这又都与AMPAR过度内吞密切相关。AMPA受体亚基胞内端结构域有许多相互作用蛋白，可以帮助AMPA受体转运并调节AMPA受体特性。在其中，蛋白激酶C相互作用蛋白(PICK1)有着独特的地位。比如，它可以调节PKCα的细胞定位和底物，从而促进AMPA受体亚基GluA2 S880的磷酸化，并且可以抑制AMPARs与ABP/GRIP的结合，参与AMPARs的内化，下调含GluR2的AMPA受体数量。
[0003]迄今为止，AD仍然无法治愈，只能通过有限的药物干预缓解症状。虽然人们投入了巨大的研发资源，但是几乎所有的临床三期试验都失败了(临床前失败率为50％，临床失败率高达99.6％)。目前市面上的阿尔兹海默症药物几乎没有效果显著的，这些药物虽然能一定程度地缓解或治疗病情，但往往有以下缺点：(1)大多数都针对表象而非针对机理；(2)都缺少临床有效性；(3)有严重的副反应；(4)抑制剂类药物都是外源的小分子，清除这些分子会对机体带来一定负荷。[0004]针对上述问题，特提出本发明。发明内容
[0005]针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种合成多肽及其合成方法和应用。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：[0006]一种合成多肽，包括一段能够选择性地破坏AMPAR亚基GluA2与蛋白激酶C相互作用蛋白1结合的功能性多肽序列，为AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列的相似序列，所述AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述功能性多肽序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的相似度大于60％。[0007]优选的，所述功能性多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。[0008]优选的，还包括能够穿透细胞膜的一段多肽序列，所述合成多肽由所述功能性多肽序列和能够穿透细胞膜的一段多肽序列重组获得。[0009]优选的，能够穿透细胞膜的一段多肽序列选自人类免疫缺陷病毒的部分氨基酸序
3
CN 112390874 A
说 明 书
2/6页
列。
优选的，所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011]优选的，所述合成多肽为直链结构。[0012]编码上述合成多肽的基因。
[0013]上述合成多肽在制备预防或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。[0014]上述合成多肽的合成方法为以树脂作为合成多肽合成的载体，以异亮氨酸作为第一个连接到树脂上的氨基酸，按照SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列逐一将上一氨基酸的-NH2与第二个氨基酸赖氨酸的-COOH缩合，然后将合成多肽自树脂上脱除获得合成多肽粗制品，粗制品纯化后即获得所述合成多肽。[0015]优选的，包括如下步骤：
[0016]a.将第一个氨基酸(异亮氨酸)的-COOH用N,N-二异丙基乙胺连接到Cl树脂上，然后将树脂上未反应完的功能团用甲醇封闭；[0017]b.用DMF洗涤；
[0018]c.用哌啶去除第一个氨基酸中-NH2的保护基团9-芴甲氧羰基，使-NH2裸露；[0019]d.用DMF洗涤；
[0020]e.将第二个氨基酸(赖氨酸)的-COOH用N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑活化，然后缩合至第一个氨基酸中的-NH2上，形成酰胺键；[0021]f.用DMF洗涤；
[0022]g.用哌啶去除第二个氨基酸中-NH2的保护基团9-芴甲氧羰基，使-NH2裸露；[0023]h.用DMF洗涤；
[0024]i.重复步骤e-h直到最后一个氨基酸(酪氨酸)的-NH2裸露；[0025]j.加入切割试剂，将多肽从树脂上切割，并切除所有氨基酸的侧链保护基团，得切割液；
[0026]k.将切割液加入乙醚中，使多肽沉淀，离心即得到多肽粗品，粗制品纯化后即获得所述合成多肽。[0027]有益效果：[0028]1、本发明提供的合成多肽为AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列(IESVKI，SEQ ID NO:1)的相似序列，AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列(IESVKI，SEQ ID NO:1)为蛋白激酶C相互作用蛋白1(PICK1)与GluA2相互结合并作用的位点，本发明提供的合成多肽首先以AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列(IESVKI，SEQ ID NO:1)为模板，然后将其中的丝氨酸替换为谷氨酸，之后去掉前两个氨基酸形成，本发明提供的合成多肽能够选择性地破坏GluA2-PICK1的结合，进而改善机体内寡聚体造成的突触抑制现象。[0029]2、本发明提供的合成多肽通过化学合成的方法在其功能性多肽序列的氨基端添加了一段人类免疫缺陷病毒(HIV)的氨基酸序列，重组后的合成多肽(TAT-A2C)能够穿透细胞膜到细胞中发挥功能，其能够有效改善Aβ寡聚体造成的突触抑制现象，且无其他异常反应。
[0030]3、本发明提供的合成多肽功能区域为内源性蛋白上的一段序列，几乎不会引起细胞的排斥反应。[0031]4、本发明提供的合成多肽发挥作用所涉及到的机制已知，即为阻断寡聚体对突触
4
[0010]
CN 112390874 A
说 明 书
3/6页
的抑制作用，安全性能高，可用于制备预防或治疗阿尔兹海默症的药物，应用前景广阔。[0032]5、本发明提供的合成多肽的本质是一段氨基酸序列，便于降解，不会造成身体器官的负荷。
附图说明
[0033]图1为本发明的合成多肽经合成纯化后的高效液相色谱图。[0034]图2为本发明的合成多肽经合成纯化后的质谱图。[0035]图3为Aβ寡聚体导致突触抑制现象的验证图。
[0036]图4为本发明的合成多肽对寡聚体造成的突触抑制的影响实验图。
具体实施方式
[0037]为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。[0038]我们通过Aβ寡聚体模拟AD样表型，发现寡聚体的毒性作用，例如异常的突触可塑性、增加的树突棘丢失和受损的认知功能等等，这些都与AMPAR亚基GluA2的羧基末端结构域(CTD)与蛋白激酶C相互作用蛋白1(PICK1)的相互作用密切相关。根据以上发现推断合成干扰PICK1-GluA2相互作用的多肽可阻断寡聚体对突触的抑制作用，并且很有可能可以阻断寡聚体乃至其他AD病因所引起的AD样表型。[0039]实施例1
[0040]本具体实施例中提供的合成多肽包括一段能够选择性地破坏AMPAR亚基GluA2与蛋白激酶C相互作用蛋白1(PICK1)结合的功能性多肽序列，该功能性多肽序列为AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列的相似序列，所述AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述功能性多肽序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的相似度大于60％，AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列(IESVKI，SEQ ID NO:1)为PICK1与GluA2相互结合并作用的位点，研究显示，PICK1与GluA2的结合与AMPAR转运密切相关，基于此，本具体实施例中的功能性多肽序列首先以AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列(IESVKI，SEQ ID NO:1)为模板，然后将其中的丝氨酸替换为谷氨酸，之后去掉前两个氨基酸形成本发明的能够选择性地破坏GluA2-PICK1结合的功能性多肽序列，本具体实施例中的功能性多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明提供的包括本具体实施例的功能性多肽的合成多肽能够改善机体内寡聚体造成的突触抑制现象。[0041]该合成多肽应用于制备预防或治疗阿尔兹海默症的药物中，其能够有效改善Aβ寡聚体造成的突触抑制现象。
[0042]上述合成多肽可以通过化学合成的方法获得，也可以通过基因工程的方法合成编码上述合成多肽的基因，进而获取上述合成多肽。[0043]实施例2
[0044]本具体实施例中提供的合成多肽除包括实施例1中的功能性多肽序列外，还包括能够穿透细胞膜的一段多肽序列。该合成多肽是由实施例1中的功能性多肽序列和能够穿透细胞膜的一段多肽序列重组获得，该合成多肽为直链结构，该合成多肽应用于制备预防
5
CN 112390874 A
说 明 书
4/6页
或治疗阿尔兹海默症的药物中，其能够穿透细胞膜到细胞中发挥功能，其能够有效改善Aβ寡聚体造成的突触抑制现象，且无其他异常反应。
[0045]上述合成多肽可以通过化学合成的方法获得，也可以通过基因工程的方法合成编码上述合成多肽的基因，进而获取上述合成多肽。[0046]实施例3
[0047]本具体实施例中提供的合成多肽中能够穿透细胞膜的一段多肽序列选自人类免疫缺陷病毒的部分氨基酸序列。[0048]进一步的，该合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，该合成多肽以AMPAR亚基GluA2羧基端的一段多肽序列的相似序列(EVKI，SEQ ID NO:2)为核心序列，通过化学合成的方法，在该多肽的氨基端添加了一段人类免疫缺陷病毒(HIV)的氨基酸序列，重组后的合成多肽(TAT-A2C)能够穿透细胞膜到细胞中发挥功能，其能够有效改善Aβ寡聚体造成的突触抑制现象，且无其他异常反应。
[0049]本具体实施例中提供的合成多肽为直链结构。[0050]进一步的，上述合成多肽不仅可以通过化学合成的方法获得，其也可以通过基因工程的方法合成编码上述合成多肽的基因，进而获取上述合成多肽。
[0051]本具体实施例中提供的合成多肽可以应用于制备预防或治疗阿尔兹海默症的药物中，该合成多肽的功能区域为内源性蛋白上的一段序列，几乎不会引起细胞的排斥反应，并且发挥作用所涉及到的机制已知，即为阻断寡聚体对突触的抑制作用，安全性能高，其本质是一段氨基酸序列，便于降解，不会造成身体器官的负荷。[0052]实施例4
[0053]本具体实施例中提供了一种实施例3中提供的合成多肽的合成方法，该合成方法为以树脂作为合成多肽合成的载体，以异亮氨酸作为第一个连接到树脂上的氨基酸，按照SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列逐一将上一氨基酸的-NH2与第二个氨基酸赖氨酸的-COOH缩合，然后将合成多肽自树脂上脱除获得合成多肽粗制品，粗制品纯化后即获得所述合成多肽，具体包括如下步骤：
[0054]a.将第一个氨基酸(异亮氨酸)的-COOH用N,N-二异丙基乙胺连接到Cl树脂上，然后将树脂上未反应完的功能团用甲醇封闭；[0055]b.用DMF洗涤；
[0056]c.用哌啶去除第一个氨基酸中-NH2的保护基团9-芴甲氧羰基，使-NH2裸露；[0057]d.用DMF洗涤；
[0058]e.将第二个氨基酸(赖氨酸)的-COOH用N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑活化，然后缩合至第一个氨基酸中的-NH2上，形成酰胺键；[0059]f.用DMF洗涤；
[0060]g.用哌啶去除第二个氨基酸中-NH2的保护基团9-芴甲氧羰基，使-NH2裸露；[0061]h.用DMF洗涤；
[0062]i.重复步骤e-h直到最后一个氨基酸(酪氨酸)的-NH2裸露；[0063]j.加入切割试剂，将多肽从树脂上切割，并切除所有氨基酸的侧链保护基团，得切割液；
[0064]k.将切割液加入乙醚中，使多肽沉淀，离心即得到多肽粗品，粗制品纯化后即获得
6
CN 112390874 A
说 明 书
5/6页
所述合成多肽。[0065]进一步的，步骤(j)中的切割试剂为：三氟乙酸+乙二硫醇+苯酚+茴香硫醚+水。[0066]实施例5
[0067]合成多肽(TAT-A2C)改善Aβ寡聚体造成的突触抑制现象的验证实验。[0068]1、合成多肽(TAT-A2C)的合成[0069]1.1主要原料：Cl树脂、氨基酸、DIEA(N,N-二异丙基乙胺)、DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)、HOBT(1-羟基苯并三唑)、DMF(二甲基甲酰胺)、Piperidine(哌啶)、三氟乙酸、乙二硫醇、苯酚、茴香硫醚、甲醇和水。[0070]1.2合成思路：[0071]树脂：Cl-Resin[0072]路线：固相Fmoc(9-芴甲氧羰基)[0073]缩合：DIC+HOBT[0074]去保护：Piperidine[0075]仪器：全自动合成仪[0076]1.3具体步骤：
[0077]a.将第一个氨基酸(I异亮氨酸)的-COOH用DIEA连接到Cl-Resin，然后将树脂上未反应完的功能团用甲醇封闭；[0078]b.用DMF洗涤；
[0079]c.用Piperidine去除第一个氨基酸中-NH2的保护基团Fmoc，使-NH2裸露；[0080]d.用DMF洗涤；
[0081]e.将第二个氨基酸(K赖氨酸)的-COOH用DIC+HOBT活化，然后缩合至第一个氨基酸中的-NH2上，形成酰胺键；[0082]f.用DMF洗涤；
[0083]g.用Pip去除第二个氨基酸中-NH2的保护基团Fmoc，使-NH2裸露；[0084]h.用DMF洗涤；
[0085]i.重复e-h直到最后一个氨基酸(Y酪氨酸)的-NH2裸露；[0086]j.将多肽从树脂上切割，并切除所有氨基酸的侧链保护基团，切割试剂为：三氟乙酸+乙二硫醇+苯酚+茴香硫醚+水；[0087]k.将切割液加入乙醚中，使多肽沉淀，离心即得到多肽粗品。[0088]1.4纯化
[0089]1)试剂及仪器：乙腈，甲醇，TFA(三氟乙酸)，纯水，RP-HPLC仪器，C18制备/分析柱。[0090]2)纯化方法：梯度洗脱。[0091]1.5产物检测
[0092]将所得产物合成多肽(TAT-A2C)进行色谱、质谱检测，结果如图1和2所示，质谱和高效液相色谱结果显示该多肽分子量为2255.5，与预期一致，多肽纯度达98.94％，纯度较高，可用于细胞实验。[0093]2、Aβ寡聚体导致突触抑制现象[0094]制备野生型小鼠的急性脑切片，并在海马区的CA3-CA1环路进行全细胞电生理记录，先稳定记录5分钟的兴奋性突触后电流(EPSC)，随后在人工脑脊液中加入500nM的Aβ寡
7
CN 112390874 A
说 明 书
6/6页
聚体或者同体积的PBS作为对照。结果如图3所示，图中标识中Ctrl组为加入PBS的对照组、Aβoligomer组为加入Aβ寡聚体的实验组。由图中可以看出，与对照组相比，Aβ寡聚体EPSC的抑制作用显著。[0095]3、合成多肽(TAT-A2C)改善Aβ寡聚体造成的突触抑制现象的验证实验[0096]制备野生型小鼠的急性脑切片，并在海马区的CA3-CA1环路进行全细胞电生理记录，先稳定记录5分钟的兴奋性突触后电流(EPSC)，随后在人工脑脊液中加入500nM的Aβ寡聚体，在细胞内液中加入TAT-A2C多肽(50毫克每毫升)或等体积PBS作为对照。结果如图4所示，图中标识中Aβoligomer组为电极内液加入PBS的对照组、Aβoligomer+TAT-A2C组为电极内液加入TAT-A2C合成多肽改善Aβ寡聚体造成的突触抑制现象的实验组，由图中可以看出，与对照组相比，TAT-A2C合成多肽能够显著阻断Aβ寡聚体对EPSC的抑制作用，表明本发明提供的合成多肽能够有效的改善Aβ寡聚体造成的突触抑制现象。[0097]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化均囊括在本发明内。[0098]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
8
CN 112390874 A
序 列 表
1/1页
序列表<110> 东南大学<120> 一种合成多肽及其合成方法和应用<160> 3<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 6<212> PRT<213> 小鼠(Mus musculus)<400> 1Ile Glu Ser Val Lys Ile1 5<210> 2<211> 4<212> PRT<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2Glu Val Lys Ile1
<210> 3<211> 15<212> PRT<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Glu Val Lys Ile1 5 10 15
9
CN 112390874 A
说 明 书 附 图
1/2页
图1
图2
10
CN 112390874 A
说 明 书 附 图
2/2页
图3
图4
11
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容