NK细胞制备操作规程

1. 目的

为规范技术人员NK细胞操作，特制订本管理制度。

2. 范围

本规程适用于科贝细胞治疗。本规程适用于NK细胞制备的实验过程。

3. 职责

实验室技术人员负责本规程的实施。

4. 工作程序

4.1. 抽取病人外周血60ml（红盖管1管，绿盖管6管）。

4.2. 将红盖管里的血转入50ml离心管里，离心2000r，20min（湘仪台式低速离心机L-550，离心机升降速度均调为2），取上层血清，并加入3P-A-L（3P-A-L浓度10％）。

4.3. 将绿盖管中的血加入到悬浮液中（血：悬浮液=10:1），轻轻混匀。

4.4. 将细胞分离液加入50ml离心管中，将中的血沿着管壁缓慢加入分离液中（血：分离液=2：1）。

4.5. 将中的血放入离心机中离心2000r，20min，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的50ml离心管中。

4.6. 向取出的白膜层中加入细胞洗液10ml，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心1500r，8min（离心机升降速度可调为8），离心结束，弃上清。依照上述步骤，加入6ml洗液，1500r，5min再洗一次。

4.7. 用PBS将包被好的培养瓶洗涤两次备用。

4.8. 向离心好的细胞中加入细胞接种液，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里（血：接种液=2:1）。再将中处理过的血清加入培养瓶中（血清浓度10％）。

4.9. 将培养瓶置于37℃，5％二氧化碳培养箱培养。

4.10. 当细胞生长到第三天时，向培养瓶中加入NKB1和NKB2各1ml。

4.11. 配制培养基：每1000ml培养基中加入2-3ml修正液和2支白介素-2。

4.12. 当细胞生长到第四天时，向培养瓶中加入中处理好的培养基。

4.13. 以后每天观察，根据细胞悬液颜色添加培养基，每次按瓶中已有培养基等比例添加。若一个培养瓶中培养物的量达到max线，则采取分瓶处理。

4.14. 当细胞生长到约第9-11天时，根据细胞的生长情况,转移到培养袋培养（气泡尽量排空，以免影响细胞生长）。

4.15. 以后每天观察，根据细胞悬液颜色添加培养基，每次按袋中已有培养基等比例添加。

4.16. 约培养至第十五或十六天，进行计数，当细胞达到所需剂量时，即可离心收细胞待用，同时对细胞进行质量鉴定。

4.17. 将完成好的细胞悬液封好，核对病人姓名、性别、年龄、医院和质量鉴定结果等信息无误后，贴上标签，填好相应表格并签名后，送回进行回输。

5. 记录表格:NK细胞治疗操作流程记录表》

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