(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111560469 A(43)申请公布日 2020.08.21
(21)申请号 202010234297.3(22)申请日 2020.03.30
(71)申请人 广州和盛医疗科技有限公司
地址 510288 广东省广州市海珠区大干围
38号南华西第五工业区自编13号楼1C03室(72)发明人 周海军 吴家波 (51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页序列表6页 附图1页
(54)发明名称
一组检测新冠病毒基因的引物及CRISPR序列组合及其应用(57)摘要
本发明提供一种检测一组检测新冠病毒基因的引物及CRISPR序列组合及其应用，包括分别检测病毒ORF1ab基因和N基因的两组RPA等温扩增用引物对，以及可分别检测RPA扩增产物的2条crRNA序列。通过本发明的体系检测可同时检测ORF1ab基因和N基因，操作简便，每个检测样品只需单管进行；反应全程在37℃左右的温度下进行，不需要如PCR扩增那样需要精细的温控元件及复杂的温度变化，适合基层单位用相对廉价的即时检测设备进行检测；灵敏度达到10拷贝/uL。与PCR技术相比速度更快，可在30min内可有明显的检测信号，可快速地判断样品中2019-nCoV新型冠状病毒核酸是否阳性。
CN 111560469 ACN 111560469 A
权 利 要 求 书
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1.一种试剂盒，其特征在于：其包括一组检测2019-nCoV ORF1ab基因和N基因特异位点引物，包括扩增ORF1ab基因的P1、P2引物序列，扩增N基因的P3、P4引物序列，所述引物序列如SEQ ID NO：1～4所示。
2.一种同时检测2019-nCoV ORF1ab基因和N基因特异位点的核酸序列组合，其特征在于，包括分别扩增ORF1ab和N基因特定位点的引物对，以及对应的识别ORF1ab和N基因的2个crRNA序列；每个CrRNA序列分别和两种不同的Cas13蛋白结合，形成两个不同的CrRNA/Cas13复合体，分别特异地检测ORF1ab和N基因。
3.如权利要求2所述的核酸序列组合，其特征在于所述两个CrRNA/Cas13复合体，识别ORF1ab基因特异片段的crRNA1与PsmCas13b蛋白结合；识别N基因特异片段的crRNA2与CcaCas13b蛋白结合。
4.如权利要求2所述的核酸序列组合，其特征在于所述crRNA1序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
5.如权利要求3所述的核酸序列组合，其特征在于，所述crRNA2序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
6.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：扩增引物和crRNA序列，混合在同一个检测反应管进行检测反应。
7.权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述检测反应管为50uL，包含：P1、P2、P3、P4引物各0.48μM；RT-RPA缓冲液2μL；ProtoScript RT反转录酶0.2μL；PsmCas13b和CcaCas13b蛋白各45nM/L；crRNA1和crRNA2各22.5nM/L；T7 RNA聚合酶1uL；RNase抑制剂1000U；NTPs 2Mm/L；MgCl2 5Mm/L；MgAc 14mM/L；甘油1uL；牛血清白蛋白0.5g/L PsmCas13b报告探针和CcaCas13b各125Nm/L。各组分混合后形成一个检测反应体系，加入待检样本1μL，可在同一管中同时检测样本中是否含ORF1ab和N基因。
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说 明 书
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一组检测新冠病毒基因的引物及CRISPR序列组合及其应用
技术领域
[0001]本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一组检测2019-nCoV新型冠状病毒ORFab1基因和N基因的检测体系及其应用。
背景技术
[0002]核酸检测是2019-nCoV的无创诊断的金标准，现2019-nCoV核酸检测普遍采取real-time RT-PCR的方法，检测试剂盒供应量上来后，不少案例发现，试剂盒检测为阴性的，实际已经感染新冠病毒，而且real-time PCR检测耗时长、操作复杂，难以满足快速增长的疑似病例排查需求。因此，对检测试剂盒的灵敏性、检测速度、价格、操作简便性等方面存在需求量。
[0003]近年来，一种发展起来的以成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)为特征的基因检测技术发展起来。CRISPR是发现于细菌和古细菌的调控型RNA，含与特定基因互补序列的CRISPR和CRISPR相关蛋白(Cas)形成的复合体具有针对特定基因的内切酶效应，是近年来十分热门和有前景的基因编辑工具。在 CRISPR/Cas系统中，Cas蛋白在CrRNA(CRISPR-derivedRNA，其基本构成为：锚定序列+向导序列)的引导下，识别目标序列后启动“附带切割”活性。一般的CRISPR/Cas系统用于DNA靶序列切割，2016年张锋研究组首次描述了 RNA靶向CRISPR酶，现在称为Cas13a，可以用于切割细菌细胞中的特殊RNA 序列。Cas13a与DNA靶向CRISPR酶(如Cas9和Cpf1)不同，这种酶在切割其靶向RNA后可保持活性，而且可能表现“旁切割”(collateral cleavage)，继续切割其它非靶向RNA。这意味着Cas13a检测到其靶标后可攻击所有 RNA。这种活性可以被用作一个自动放大检测器，作为一种低成本的诊断已成为一种可能。到目前为止，共发现来源于三种不同种属来具有的旁切割效应的 Cas13蛋白，包括：PsmCas13b、LwaCas13a和Cca13b，而且它们之间还有不同的旁切割碱基序列的偏好性。这也意味着不同的CRISPR/Cas13可以联合使用，实现单管多重基因检测。研究结果表明：CRISPR/Cas13和RPA扩增技术 (等温扩增技术)结合起来的新系统能够以极低浓度检测单RNA和单DNA分子，可将检测的灵敏度提高到埃摩尔(aM)。[0004]2020年2月14日，张锋教授团队发布了使用基于CRISPR/Cas13的 SHERLOCK技术检测新型冠状病毒的详细操作流程，其技术方案的特征是用 CrRNA/LwaCas13a分别检测确良S基因和ORF1ab，即实质仍是单管检测单基因检测，而且其灵敏度的实现是通过两步法实现的，即先是RPA扩增，在扩增的基础上需取扩增产物加入CrRNA/LwaCas13a反应体系来实现的，亦不方便操作使用。发明内容
[0005]本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一组能同时检测 2019-nCoV ORF1ab和N基因以RPA扩增和Cas13侧激活效应为基础的检测体系.同时检测两基因不会相互干扰；同时检测的灵敏度也相当，达到10拷贝/Ul. 为实现上述目的，本发明采取的
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说 明 书
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技术方案为：
[0006]本发明提供了一组同时扩增2019-ORF1ab和N基因特定位点的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO：1～4所示。其中，1～2特异扩增ORF1ab 片段，3～4特异扩增N基因片段。
[0007]在此基础上，由上述引物利用RT-RPA方法扩增的ORFab1基因片段和N 基因片段，并在T7转录酶作用下转录成对应的ssRNA。ssRNA可被对应的 crRNA/Cas13复合体识别。其中，crRNA1和PsmCas13b形成复合体，特异地识别ORF1ab特定片段ssRNA，crRNA2和CcaCas13b形成复合体，特异地识别N 基因片段ssRNA。所述crRNA1序列如SEQ ID NO：5所示，crRNA2序列如 SEQ ID NO：6所示。
[0008]两种crRNA/Cas13复合体在识别特异的转录ssRNA后，通过不同偏好的“旁切割”效应分别切割不同碱基基序的萤光基团标记单链RNA检测探针，从而通过不同的激发荧光检测ORF1ab或N基因。
[0009]本发明的有益效果：[0010](1)本发明操作简便，每个检测样品只需单管进行双基因检测，减少了因基因突变而漏检的机率；[0011](2)反应全程在37℃左右的温度下进行，不需要如PCR扩增那样需要精细的温控元件及复杂的温度变化，非常适合基层单位用相对廉价的即时检测 (POCT)设备进行检测；[0012](3)与PCR技术相比速度更快，可在30min内可有明显的检测信号；[0013](4)检测结果灵敏度高，可轻易地判断临床样品中是否含2019-nCoV核酸。附图说明
[0014]图1为实施例6检测灵敏度和特异性验证结果示意图(一步法检测灵敏度和特异性检测结果)。
[0015]
具体实施方式
[0016]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0017]本发明的具体实施例如以下说明。
[0018]施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。[0019]实施例1合成RPA引物
[0020]根据选定的ORF1ab和N基因的序列片段合成RPA扩增引物，引物序列具体见下表1、表2。RPA引物用无RNA酶纯化水溶解成母液(24μM)，分装后贮存于-20℃备用。[0021]表1：扩增ORF1ab基因片段的RPA引物序列
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[0022]
[0023]
表2：扩增N基因片段的RPA引物序列
[0024]
[0025]
实施例2、合成CrRNA
[0027]委托苏州泓迅根据合成CrRNA，CrRNAs序列信息见表3。合成的CrRNA用无 RNA酶纯化水溶解成10X母液(225nM)，分装后贮存于-20℃备用。[0028]表3：合成的CrRNAs序列
[0026]
[0029]
[0030]
实施例3、报告探针的合成
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说 明 书
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本发明Cas13酶使用的ssRNA报告探针：委托广州博徕斯合成两种ssRNA 报告探
针。序列具体信息见表4。合成的ssRNA报告探针分别用无RNA酶纯化水溶解成母液(1.25μM)，分装后贮存于-20℃备用。[0032]表4：Cas13蛋白酶使用的报告探针具体序列信息
[0033]
实施例4、PsmCas13b与CcaCas13b蛋白的表达[0035]1、PsmCas13b与CcaCas13b表达质粒的构建
[0036]根据以下序列委托苏州泓迅合成His6-TwinStrep-SUMO-PsmCas13b与 His6-TwinStrep-SUMO-CcaCas13b cDNA序列，合成的DNA序列经XbaI和XhoI 内切酶酶切处理后，克隆至pET52b表达质粒中，转化至RosettaTM 2(DE3)pLysS 菌株中筛选出阳性菌，经IPTG诱导蛋白SDS-PAGE电泳表达鉴定后保存工程菌。
[0037]合成的His6-TwinStrep-SUMO-PsmCas13b序列如SEQ ID NO：7所示。[0038]合成的His6-TwinStrep-SUMO-CcaCas13b序列如SEQ ID NO：8所示。[0039]2、PsmCas13b与CcaCas13b的表达和纯化
[0040]PsmCas13b与CcaCas13b表达和纯化具有相同的步骤，具体如下：[0041]接种工程菌种子液至TB培养基中，37℃、200RPM振荡培养至OD600＝0.5。冷却培养液至18℃后，添加IPTG至终浓度为500μM，诱导表达16小时。离心收集菌体，-80℃贮存备用。[0042]纯化步骤在4℃.下进行。菌体按1：5的比例(W/V比)用裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl，500mM NaCl，1mM DTT，pH 8.0，含溶菌酶500μg/ml)重悬，冰浴下超声破碎至镜检菌体完全破碎。4℃、10000g、1h的条件下离心，取上清，按每50-100mL上清加入5mL的比例加入StrepTactin Sepharose层析填料，室温下轻柔摇晃1h。其后离心去清加裂解缓冲液洗涤，重复三次。层析填料重悬于SUMO酶切缓冲液中(30mM TrisHCl，500mM NaCl 1mM DTT，0.15％ NP-40，250U/L SUMO酶)，4℃轻柔摇晃下过夜进行酶切处理。酶切处理取上清。将酶切处理后的上清按1；5的比例在4℃下用保存液(600mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5，5％甘油，2mM DTT)进行透析处理，共三次。其后进行5-10倍浓缩处理。取样，跑SDS-PAGE蛋白电泳，将目标分子量位置的蛋白条带和已知浓度的BSA进行对照检测目标蛋白浓度。料液-80℃贮存备用。
[0043]实施例5、反应液的配制[0044]1、建立反应体系，见表6。配好后的反应液放于-20度贮存备用.[0045]表6:反应体系的组成(50μL/管)
[0034]
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[0046]
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注:待检样本1μL临用时加入
[0049]实施例6、反应液检测灵敏度特异性的验证[0050]分别用稀释缓冲液(50mM PBS+0.2％Tween-20，pH＝7.2)稀释假病毒样品 1(含2019-nCoV ORF1ab基因RNA，MS噬菌体形式，来源于邦德适公司)、假病毒样品2(含2019-nCoV N基因RNA，MS噬菌体形式，来源于邦德适公司)、假病毒样品3(含2019-nCoV E基因RNA，MS噬菌体形式，来源于邦德适公司)、假病毒样品4(含2019-nCoV ORF1ab+E+N基因RNA，
[0048]
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MS噬菌体形式，来源于邦德适公司)至对应的基因浓度为10e4copy/ul、10e3copy/ul、10e2copy/ul、 10e1copy/ul、10e0copy/ul共5个梯度作为待检样本。同时配制空白质粒样品 (10e4copy/ul)作为阴性对照，[0051]各待检样本1mL，96-100℃的范围内水浴10min后，冷却至室温，各加1ul 样品于复溶的50ul反应液中，使用ABI7500荧光检测仪，在37℃的条件下于 30min内各管检测反应产生的Cy5、HEX萤光信号。[0052]3、结果
[0053]结果如图1所示，图中纵坐标为荧光信号强度。实验结果显示，使用本发明的检测试剂都能特异性检出。检测灵敏度达到10拷贝/反应管。[0054]反应结果如下表7所示：[0055]表7
[0056]
[0057]
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所
作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。[0059]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。[0060]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
[0058]
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序列表<110> 广州和盛医疗科技有限公司<120> 一组检测新冠病毒基因的引物及CRISPR序列组合及其应用<160> 8<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 55<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1gaaattaata cgactcacta taggggtgct aatgaccctg tgggttttac actta 55<210> 2<211> 29<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2gcggagttga tcacaactac agccataac 29<210> 3<211> 54<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3gaaattaata cgactcacta taggggaact tctcctggag aatggctggc aatg 54<210> 4<211> 30<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4cattttgctc tcaagctggt tcaatctgtc 30<210> 5<211> 66<212> RNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5agccauaacc uuuccacaua ccgcagacgg guuguagaag cuuaucguuu ggauagguau 60gacaac 66<210> 6<211> 66
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<212> RNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6ucaaucuguc aagcagcagc aaagcaagag guuggaacug cucucauuuu ggaggguaau 60cacaac 66<210> 7<211> 4474<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatgggcag cagccatcat 60catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc atatggctag ctggagccat 120ccgcagtttg aaaaaggtgg tggtagcggt ggtggttcag gtggtagtgc atggtcacac 180cctcagtttg agaaaatgtc ggactcagaa gtcaatcaag aagctaagcc agaggtcaag 240ccagaagtca agcctgagac tcacatcaat ttaaaggtgt ccgatggatc ttcagagatc 300ttcttcaaga tcaaaaagac cactccttta agaaggctga tggaagcgtt cgctaaaaga 360cagggtaagg aaatggactc cttaagattc ttgtacgacg gtattagaat ccaagctgat 420cagacccctg aagatttgga catggaggat aacgatatta ttgaggctca cagagaacag 480attggtggat ctatgtctaa ggagtgcaag aagcagcgcc aggagaagaa gcggagactg 540cagaaggcca atttctccat ctctctgacc ggcaagcacg tgttcggcgc ctactttaat 600atggccagaa caaactttgt gaaaaccatc aactacatcc tgcctatcgc cggcgtgagg 660ggcaactata gcgagaatca gatcaacaag atgctgcacg cactgttcct gatccaggca 720ggacgcaatg aggagctgac cacagagcag aagcagtggg agaagaagct gcggctgaac 780ccagagcagc agaccaagtt tcagaagctg ctgttcaagc actttccagt gctgggacca 840atgatggcag acgtggcaga tcacaaggcc tatctgaaca agaagaagag caccgtgcag 900acagaggacg agacattcgc catgctgaag ggcgtgtccc tggccgactg cctggatatc 960atctgtctga tggccgatac cctgacagag tgtagaaact tctacacaca caaggaccct 1020tataacaagc caagccagct ggccgatcag tacctgcacc aggagatgat cgccaagaag 1080ctggacaagg tggtggtggc ctccaggcgc atcctgaagg atagggaggg cctgtctgtg 1140aatgaggtgg agttcctgac cggcatcgat cacctgcacc aggaggtgct gaaggacgag 1200ttcggcaacg ccaaggtgaa ggatggcaaa gtgatgaaaa ccttcgtgga gtacgacgac 1260ttctacttca agatctccgg caagcggctg gtgaatggct acacagtgac cacaaaggac 1320gataagcccg tgaatgtgaa caccatgctg cctgccctgt ctgacttcgg cctgctgtac 1380ttctgcgtgc tgtttctgag caagccctat gccaagctgt ttatcgatga ggtgcgcctg 1440ttcgagtact ctccttttga cgataaggag aacatgatca tgtctgagat gctgagcatc 1500tatcggatca gaacaccccg gctgcacaag atcgactccc acgattctaa ggccaccctg 1560gccatggaca tcttcggcga gctgcggaga tgtcctatgg agctgtataa cctgctggac 1620aagaacgccg gccagccatt ctttcacgat gaggtgaagc acccaaactc tcacaccccc 1680gacgtgagca agcggctgag atacgacgat cgctttccta cactggccct gcggtatatc 1740
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CN 111560469 A
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说 明 书 附 图
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图1
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