ELISA酶联免疫吸附试验报告

酶联免疫吸附试验

学院：专业：姓名：学号：

一．实验原理

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。

图1 ELISA实验原理示意图

二．实验材料

BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H2SO4。

三．实验方法

1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。第二天取出，用PBS洗涤3-4次。

2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。

3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显色20min，最后加入50μl、2M H2SO4终止反应。5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。

结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

四．实验结果

表1 酶联免疫吸附OD值检测表

加样孔

1（阴

性对照）

组别

Max与

2345678

阴性对照OD值之比

ABCDE

0.4160.5150.6570.3730.367

0.3860.4090.5670.3710.432

0.30.4290.4960.7790.604

0.4050.4710.20.3500.666

0.4440.4290.5080.5140.441

0.3900.3880.3340.5020.455

0.7390.2940.2780.7800.441

0.5310.4400.2550.4060.395

1.780.911.362.091.81

目测各孔颜色较浅;检测其OD值结果如上表所示，各孔OD值与阴性对照之比都小于2.1，全部为阴性。

五 思考讨论

1.本次实验结果全部为阴性，可能原因有：（1）抗备不成功；

（2）洗涤时可能有部分抗体被洗脱下来；

（3）样品加样量不准确（实验时部分孔是批量加的样且滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，不能保证精确性和均一性）；2.其它注意事项：

（1）样品和试剂从冰箱取出后，应在室温下(18～25℃)平衡1h。

（2）在操作过程中，加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。

(3)洗涤时，请勿用带纸屑的吸水材料拍板，以防外源性过氧化物酶类或氧化还原物质与显色液发生反应，影响检测结果的准确性。

（4）包被时间不少于18h，包被板一经洗涤，则不宜存放过长时间。（5）包被和温育均应将固相载体放置湿盒内进行。

3. BSA免疫血清的制备：可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫　　加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　　　　　　　│　　　　　（一般2.0ml 0.5ml/点）　　　　　　　　↓1周后

　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip　　　　　　　　│　　（ip（腹腔内注射剂量不宜超过0.5ml/只）　　　　　　　　↓1周后

　　　　　　　第三次免疫　剂量1.0ml，不加佐剂，ip

　　　　　　　　│ （4天后采血测其效价，检测免疫效果,如果效价不理想可采取加强免疫）

第四次免疫(非必需步骤)

　　　　　　　　↓1周后

　　　　　　加强免疫，方法: 从耳静脉注射抗原0.1－0.2mL，一周后放血.ELISA常见方法 （1）间接法 将已知抗原吸附（又称包被）于固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入含有特异性抗体的被检血清，感作后洗除未起

反应的物质，加入酶标记的同种球蛋白（如被检血清是鸡血清，就需用抗鸡球蛋白），作用后再洗涤，加入酶底物。底物被分解后出现颜色反应，用酶标仪测定其吸光值（OD）。 （2）双抗夹心法 用于检测抗原。将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面，再加入被检抗原溶液，使抗原和抗体在固相表面形成复合物。洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，感作后冲洗，加入酶底物，颜色变化与待测样品中的抗原量成正比。 （3）竞争法 用酶标记抗原和未标记抗原共同竞争有限量的抗体的原理，测定样品中的抗原。同时应用只加酶标记抗原的系统作为对照。将抗体吸附于固相载体表面，感作后冲洗，加入待检抗原和酶标记抗原。对照只加酶标记抗原。感作后冲洗，加入酶的底物溶液，含酶标抗原的对照应出现颜色反应。而待检系统中，由于样品中未标记抗原的竞争作用，相应抑制了颜色反应。当待检抗原含量高时，其对抗体的竞争能力强，形成的不带酶的抗原-抗体复合物量亦多，带酶复合物的形成量相对减少，产生的有色产物量也少；反之，待检抗原含量低时，不带酶的复合物少，带酶的复合物量相对增多，最后有色产物的量增多。 除上述方法外，近年来还发展了许多改良方法，如阻断ELISA、LISA、抗体捕捉ELISA等，实际检测中可选择应用。 常用方法具体操作步骤见下表：

方法

间接法（测抗体）

步骤

（测抗原）

包被抗原：用包被包被抗体：用包被缓冲液稀释抗原至缓冲液稀释特异性

包被特异性抗体：

最适浓度抗体球蛋白至最适（5～20μg/ml）各浓度（1～10μg

0.3ml加于微反应板/ml），每凹孔加每个凹孔中,4℃过夜0.3ml，4℃过夜，

同左

或37℃水浴2～3或37℃水浴3小时，小时,贮存冰箱贮存冰箱洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次

5分钟

表2 ELISA常见方法操作步骤

双抗体夹心法

竞争法（测抗原）

抑制性测定法

包被抗原：

同左

1

2同左同左同左

3加被检标本：每凹每凹孔加入0.2ml分2组,a组加酶标a组加参考抗体和被

孔加入用含有用稀释缓冲液稀释记抗原和被检抗原检抗原混合液0.05%吐温-20的稀的含抗原的被检标混合液0.2ml，另一0.2ml，另一组加参释缓冲液稀释的被本，37℃作用1～2组只加酶标记抗原考抗体与等量稀释检血清各小时。液0.2ml，37℃作用剂0.2ml，37℃作用0.2ml，37℃，作用1～2小时。（混合1～2小时。1～2小时液可作成不同稀释度）。4洗涤：重复2同左洗涤：同左洗涤加入0.2ml用稀释加入酶结合物：每缓冲液稀释的酶标凹孔加入稀释缓冲记特异性抗体溶液，液稀释的酶结合物37℃作用1～2小时0.2ml 37℃作用或由预试实验确定1～2小时作用时间。双抗体夹心法间接法（测抗体）步骤6洗涤：重复2加入0.2ml底物溶液于每个凹孔,(O.P.D或O.T)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4ml底物加0.1ml终止剂）。加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2M柠檬酸0.05ml。观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（O.P.D用492nm）O.D值。（测抗原）同左洗涤竞争法（测抗原）抑制性测定法5各加入0.2ml抗参考抗体的酶结合物37℃作用1～2小时 方法7同左同左同左8同左同左用酶标比色计测定a、b两组O.D值，并求出a、b、O.D值的差数同左9同左同左