新型抗菌肽及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109942713 A(43)申请公布日 2019.06.28

(21)申请号 201811619127.6(22)申请日 2018.12.28

(71)申请人 广州医科大学

地址 511436 广东省广州市番禹区新造镇

广州医科大学(72)发明人 柳丛　张峰　胡葵葵　(51)Int.Cl.

C07K 19/00(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 17/08(2006.01)A61P 17/10(2006.01)

权利要求书1页 说明书2页

序列表1页

(54)发明名称

新型抗菌肽及其应用(57)摘要

本发明提供了一种新型抗菌肽，序列为：X-LVKGR-amide,其来源于葡萄糖醛酸激素GLP-1衍生的五肽GLP-1(32-36)酰胺（LVKGRamide），X经优化后得到抗菌肽HAG（FKRLKKLFKKIWNWKLVKGR-amide）和抗菌肽HBG（Decanoyl-KFKWPWLVKGR-amide），HAG和HBG具有高效抗菌活性和低细胞毒性，可广泛应用于各种需要杀菌及抑菌的产品中。

CN 109942713 ACN 109942713 A

权　利　要　求　书

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1.本发明的新型抗菌肽序列为X-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-amide,其优势在于抗菌肽与降脂短肽结合并优化，使抗菌活性和细胞毒性得到优化。

2.本发明涉及本发明的抗菌肽或其任意混合物在制备各种具有抑菌和杀菌性能的产品中的应用，这些产品包括但不限于化妆品、药品、消毒纸巾、敷料、洗面奶、女性护理洗液或饲料等等，总之，本发明的抗菌肽可以应用于一切需要杀菌或抑菌的产品中。

3.衍生的抗菌肽HAG（FKRLKKLFKKIWNWKLVKGR-amide）和抗菌肽HBG（Decanoyl- KFKWPWLVKGR -amide）是新型的抗菌肽，其优势有：（1）抗菌肽HAG和HBG具有强效抗菌活性，且优化后细胞毒性较低，可以应用于一切需要杀菌或抑菌的产品中；（2）抗菌肽两亲性质使细菌不易产生耐药，是抗生素有前景的替代品，可应用于临床消炎抗菌治疗中；（3）在治疗痤疮中除基本的抗菌活性以外，兼具独特的降脂功能，在美容行业中具有广阔前景。

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CN 109942713 A

说　明　书新型抗菌肽及其应用

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技术领域

[0001]本发明涉及生物技术领域，具体为一种新型抗菌肽及其应用。

背景技术

[0002]自1928年人类发现第一个抗生素青霉素以来，抗生素的发展迅速，也使得原本会致命的细菌感染得到治疗。然而，过去50年来抗生素耐药性的出现以及新抗生素的大量减少，已经使得人们迫切需要寻求新的治疗方法，抗菌肽是新型抗菌剂的有前景的替代药物。[0003]大多数生物体可产生抗菌肽，抗菌肽是生物体用以抵抗病原体入侵的重要防线，迄今为止已从各种生物包括植物、动物、细菌、人等中分离出超过2000种抗菌肽。多数抗菌肽具有阳离子和疏水残基，有助于保持两亲性质。一些抗菌肽可有效抵抗多重耐药的病原体，不易使微生物产生耐药，因此具有广阔的应用前景。[0004]痤疮是多种原因导致的疾病，主要与炎症反应，痤疮丙酸杆菌的增生，脂质分泌增多以及毛囊角化异常等因素有关，临床中的治疗主要以调节皮脂分泌，抑制过度角化，激活机体免疫和局部运用抗生素治疗等方法，而抗生素耐药性的增加使得局部抗菌肽的使用成为有前景的替代品。

发明内容

[0005]本发明旨在提供一种新型抗菌肽，抗菌肽序列为：X-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-amide，其来源于葡萄糖醛酸激素GLP-1衍生的五肽GLP-1(32-36)酰胺（LVKGRamide），在优选的技术方案中，X来源于幽门螺旋杆菌衍生的多肽HPA3NT3（FKRLKKLFKKIWNWK）或多肽HB1345（Decanoyl-KFKWPW）。本发明选择性的优化了X的多肽序列后与五肽短肽连接。制备成具有高效抗菌活性和降脂功能的多肽序列。[0006]优化后得到抗菌肽HAG和抗菌肽HBG，多肽序列详见0017。[0007]本发明的抗菌肽具有广谱的抗菌活性，不仅活性高，而且几乎无细胞毒性，尤其在治疗痤疮的过程中，不仅对痤疮丙酸杆菌具有强抗菌活性，同时兼具降低皮脂分泌的功能，能更有效的抵抗痤疮丙酸杆菌感染对皮肤的炎症反应。[0008]根据本发明的一个方面，本发明涉及本发明的抗菌肽或其任意混合物在制备各种具有抑菌和杀菌性能的产品中的应用。这些产品包括但不限于化妆品、药品、消毒纸巾、敷料、洗面奶、女性护理洗液或饲料等等。总之，本发明的抗菌肽可以应用于一切需要杀菌或抑菌的产品中。

[0009]本发明的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。[0010]具体实施方式：抗菌肽的抗菌活性测定

1. 取痤疮丙酸杆菌（菌株ATCC6919）菌液100ul于10ml新鲜LB培养基中培养2~3天，至对数生长期后酶标仪检测吸光度值，稀释至OD690值为0.2~0.25备用，对应细菌密度约10^8CFU/ml。

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CN 109942713 A[0011]

说　明　书

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2.用无菌PBS溶液溶解抗菌肽HAG和抗菌肽HBG至浓度为100mg/ml。用无菌PBS溶液

溶解克林霉素磷酸酯至浓度为100mg/ml。用新鲜LB培养基以倍比稀释法稀释多肽和克林霉素磷酸酯至终浓度为3.1-100ug/ml。[0012]3.菌液OD690值为0.20.25。取96孔板，于空白对照组中加入200ul新鲜LB培养基，

~

于阴性对照组中加入100ul菌液和100ul培养基，于测试组中加入100ul菌液和100ul不同浓度的多肽溶液，至多肽终浓度为1.6-50ug/ml。[0013]4. 将加好的96孔板标注后，37℃，厌氧环境下培养48h。酶标仪检测600nm处吸光度值，无细菌生长为最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentrations，MIC)。[0014]实验结果显示，抗菌肽HAG的MIC为12.5ug/ml，抗菌肽HBG的MIC为3.1ug/ml。[0015]实施例2：抗菌肽的细胞毒性测定

1. 用WST检查试剂盒检测细胞增殖与凋亡实验。对人永生化角质形成细胞和SZ95皮脂腺细胞进行抗菌肽毒性检测，96孔板每孔接种细胞密度为3000个细胞，加入抗菌肽HAG和抗菌肽HBG至终浓度为50~400ug/ml。24h后每100ul培养基加入10ulWST检测液，1h后酶标仪检测激发光为450nm处的吸光度值。结果显示，抗菌肽HAG和抗菌肽HBG在400ug/ml浓度时，对人永生化角质形成细胞未显示出细胞毒性，无统计学意义。抗菌肽HAG在100ug/ml时对SZ95皮脂腺细胞显示出微量毒性，50ug/ml及更低浓度时未显示出细胞毒性。[0016]实施例3：抗菌肽将甘油三酯检测

1.用甘油三酯试剂盒检测SZ95皮脂腺细胞内甘油三酯含量。将SZ95皮脂腺细胞培养至70%汇合后，加入抗菌肽HAG、HBG、GLP-1(32-36)酰胺、克林霉素，浓度均为50ug/ml，24h后检测甘油三酯含量。结果显示HAG、HBG能明显降低SZ95皮脂腺细胞内甘油三酯含量，具有有效的降脂功能。最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，凡是局部的变更或修饰而源于本发明的技术思想而为熟悉该领域技术的人员所易于推知的，俱不脱离本发明的专利权范围。[0017]抗菌肽HAG：

Phe-Lys-Arg-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Trp-Asn-Trp-Lys-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-amide；

抗菌肽HBG：

Decanoyl-Lys-Phe-Lys-Trp-Pro-Trp- Leu-Val-Lys-Gly-Arg-amide。

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CN 109942713 A

序　列　表

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                         序列表<110>  广州医科大学<120>  新型抗菌肽及其应用<141>  2018-12-28<160>  2<170>  SIPOSequenceListing 1.0<210>  2<211>  20<212>  PRT<213>  人工序列(Artificial Sequence)<220><221>  ACETYLATION<222>  (20)..(20)<223>  c端连酰胺<400>  2Phe Lys Arg Leu Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Trp Asn Trp Lys Leu1               5                   10                  15Val Lys Gly Arg            20<210>  3<211>  11<212>  PRT<213>  人工序列(Artificial Sequence)<220><221>  ACETYLATION<222>  (11)..(11)<223>  C端酰胺<220><221>  ACETYLATION<222>  (1)..(1)<223>  N端连葵酰基<400>  3Lys Phe Lys Trp Pro Trp Leu Val Lys Gly Arg1               5                   10

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