高温堆肥发酵菌剂筛选及在粪污处理上的应用

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畜牧业环境 2021.06

高温堆肥发酵菌剂筛选及在粪污处理上的应用

马荣坤1，潘孝青2，3*

（1.镇江希玛牧业有限责任公司，江苏镇江 212100；2.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京 210014；3.农业部种养结合重点实验室，江苏南京 210014）

摘　要：为提高规模猪场粪污处理效率，从镇江某猪场高温堆积发酵的粪污中分离筛选耐高温发酵菌并扩培制成混合菌剂，进行粪污堆积发酵试验，结果显示，10个样品中分离得到9株耐高温细菌。经选择性培养基筛选，其中5株细菌具有降解至少一种底物的能力，筛选获得的GW03菌种的纤维素酶活力及淀粉酶活力在5株菌种中属最优，GW02菌种的蛋白酶活力最优；GW03菌种在堆肥发酵过程中2天达到70℃，与其他筛选菌种相比，最高温度达79.1℃；GW05菌种3天达到70℃，与其他筛选菌种相比，最高温度持续17天；不同高温发酵菌剂处理猪粪污后形成的腐熟粪肥中，GW04菌种有机质、氮素、P2O5含量最高，其中有机质、氮素含量与其他四种菌种相比，差异显著（P＜0.05）；GW02、GW04菌种处理猪粪污后形成的腐熟粪肥中，K2O含量最高，与其他三种菌种相比，差异显著（P＜0.05）。试验结果表明，本文所述的高温菌种筛选方法和粪污发酵方案可以用于猪粪污快速堆积发酵处理。

关键词：高温菌；筛选；粪污处理1　前言

高温堆肥发酵可显著提高畜禽粪污中有机大分子的分解，一定程度上降低病原微生物数量，是粪污无害化处理的关键技术[1]。但高温条件下，微生物种群及相关酶活性显著受到抑制，极大地了大分子难降解物质的快速降解。高温菌具有代谢快、活性高、酶的热稳定性高、营造高温条件杀死病原菌等特点，对于高温环境下有机物质的生物转化具有重要作用，与常温菌相比具有更高的微生物代谢活性和有机物降解速率，在畜禽粪污处理及资源化利用领域具有广阔的应用前景，通过接种高温降解菌可以增加堆肥高温期微生物的数量，加速难降解粪污中有机物质的快速转化，有效提高粪污处理效率[2-3]。

目前对于高温堆肥发酵菌的研究大多仅关注一种大分子物质的降解，对于能同时降解多种有机物的高温菌研究较少。本文从高温堆积发酵的粪污中分离筛选耐高温发酵菌并扩培制成混合菌剂，筛选具有同时降解纤维素、蛋白质、淀粉三种有机大分子能力的高温菌，旨在为规模猪场粪污快速

基金项目：镇江市重点研发计划-现代农业项目：规模猪场粪污无害化处理关键技术集成应用与示范（NY2019020）

作者简介：马荣坤（1963-），男，江苏镇江人，研究方向：畜牧生产及畜禽粪污资源化利用研究。

通讯作者：潘孝青（1983-），男，江苏句容人，副研究员，研究方向：畜禽粪污治理与生态健康养殖研究。

处理提供优良菌株，有效的促进猪粪粪污快速腐解、缩短处理周期，提高粪污的腐熟程度，降低粪污中病原微生物数量。

2　材料与方法2.1　材料

高温堆肥发酵菌筛选材料来源于高温堆积发酵阶段的粪污。

2.2　培养基

2.2.1　驯化培养基。牛肉膏10g，NaCl 5g，蛋白胨5g，H2O 1 000ml，pH7.0，121℃灭菌20min。

2.2.2　选择培养基。纤维素刚果红培养基：羧甲基纤维素钠1.88g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，明胶2.0g，刚果红0.2g，植物凝胶10g，琼脂15g，H2O 1 000mL pH 7.0～7.2g，121℃灭菌20min。

蛋白选择培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，酪蛋白5g，CaCl2 0.1g，L—酪氨酸0.1g，植物凝胶15g，H2O 1 000mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌冷却至60℃，加入 1% 115℃灭菌的吐温80。

淀粉选择培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨 10g，酵母粉5g，氯化钠10g，pH 7.0，植物凝胶20g，曲利苯蓝0.05g，H2O 1 000mL，121℃灭菌30 min。

2.2.3　发酵培养基。纤维素发酵培养基：羧甲基纤维素钠5g，NaNO3 2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.6g，NaCl 0.1g，CaCl20.1g，FeCl3 0.01g，明胶2g，酵母粉0.1g，H2O 1 000mL，pH 6.8-7.2。蛋白发酵培养基：干酪素5%，Mandel A盐10%，Mandel B盐1%，pH6.0Mandel A盐：KH2PO4 2g/L，（NH4）2SO4 1.4g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L；MandelB盐：FeSO45mg/L，MnSO4 1.6mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，CoCl 2mg/L。

2.3　筛选

2.3.1　初筛。样品制成悬浮液经75℃高温富集后，将样品悬浮液制成不同稀释度的菌液并涂布于驯化培养基平板上，倒置于75℃培养箱中培养24h。将形态特征不同的菌落挑出，再次在驯化培养基平板上经过5次划线纯化，分离得到耐高温纯菌株。将分离得到的耐高温菌株分别接种至纤维素刚果红培养基、淀粉选择培养基、蛋白选择培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈。若出现透明水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力。

2.3.2　复筛。将初筛得到的菌株接种至纤维素、淀粉、蛋白液体发酵培养基中，75℃静止培养72h后，取发酵液6 000rpm离心8min，得到粗酶液。分别用DNS法、改良的Yoo法和福林试剂法测定菌株的纤维素酶活力、淀粉酶活力和蛋白酶活

力。

2.4　应用

2.4.1　发酵底物与堆积发酵。选择通透性强、吸湿性好的木屑、稻壳，与粪污进行重量比3：7进行混合堆积，高度为1 m。添加复筛获得的粗酶液后进行混合搅拌，每隔12h进行翻堆操作，连续监测7d床体20 cm处温度。

2.4.2　发酵效果分析。对复筛获得菌种进行扩大培养后喷晒至粪污中，按2.4.1方式进行接种发酵处理，对高温发酵后30d的粪肥进行营养物质测定，有机质含量采用重铬酸钾法测定，TN采用凯氏定氮法测定，TP采用钼黄比色法测定，K元素测定：用：高氯酸=4：1在130℃～200℃条件下消煮，采用ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪感应耦合等离子体质谱仪测定。3　结果

3.1　高温发酵菌酶活力测定结果

样品经80℃高温富集培养后，10个样品中分离得到9株耐高温细菌。经选择性培养基筛选，其中5株细菌具有降解至少一种底物的能力，分别命名为GW01—GW 05，将5株菌进行摇瓶发酵培养，测定粗酶液纤维素、蛋白、淀粉酶活，酶活力测定结果见表1。如表1所示，筛选获得的GW03菌种的纤维素酶活力及淀粉酶活力在5株菌种中属最优，GW02菌种的蛋白酶活力最优。

表1　酶活力测定结果

菌种纤维素酶活力蛋白酶活力淀粉酶活力（U/ml）

（U/ml）（U/ml）GW016.8179.6223.11GW 025.32122.3522.13GW 039.96111.5329.15GW 044.5769.3220.66GW 05

6.87

.32

12.53

3.2　不同高温发酵菌剂的堆肥过程温度特性

如表2所示，GW03菌种在堆肥发酵过程中2d达到70℃，与其他筛选菌种相比，最高温度达79.1℃；GW05菌种3d达到70℃，与其他筛选菌种相比，最高温度持续17d。

表2　不同高温发酵菌剂的堆肥过程温度特性

菌种达70℃所需天

最高温最高温度（d）

（℃）持续天（d）

GW01274.3±2.416GW 02376.6±2.215GW 03279.1±2.115GW 04372.1±1.513GW 05

3

76.4±1.8

17

3.3　不同高温发酵菌剂处理猪粪污腐熟粪肥营养物质比较

如表3所示，不同高温发酵菌剂处理猪粪污后形成的腐熟粪肥中，GW04菌种有机质、氮素、P2O5含量最高，其中有机质、氮素含量与其他四种菌种相比，差异显著（P＜0.05）；GW02、GW04菌种处理猪粪污后形成的腐熟粪

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环保治理

2021.06 畜牧业环境

肥中，K2O含量最高，与其他三种菌种相比，差异显著（P＜0.05）。

表3 不同高温发酵菌剂处理猪粪污后腐熟粪肥

营养物质比较

菌种有机质（%）N（mg/g）P2O5（mg/g）K2O（mg/g）GW0141.23±4.42a15.13±1.17a47.91±0.28ab42.15±0.13bGW 0242.16±2.37a15.29±0.57a45.32±0.17a50.76±0.24bGW 0338.±1.31a14.16±0.31a48.87±0.27ab41.36±0.72aGW 0447.52±3.24b17.79±0.27b52.59±0.41b49.15±0.19bGW 00.79±0.92a13.12±0.15a47.12±0.23ab40.12±0.21a4　讨论

菌剂对粪污处理时发酵温度的影响是评价粪污处理效果的重要指标之一，温度过低或高温持续时间太短，粪污不能完全腐熟，同时不能有效地杀死粪污中的病原菌。相关研究表明[4-5]，添加复合腐解菌剂可以加速堆体升温，并可以维持较长的高温期。本研究从高温堆积发酵的粪污中分离筛选耐高温发酵菌种并扩培制成混合菌剂，进行粪污堆积发酵试验，得到的高温发酵菌剂在猪粪污堆肥发酵过程中2d即达到70℃，最高温度可达79.1℃，最高温度持续17d，表明本文所述的高温菌种筛选方法和粪污发酵方案可以用于猪粪污快熟处理。

氮素是微生物生长代谢的重要营养物质，氮素含量的改变能显著影响粪污腐熟效率。本研究分离筛选到的耐高温发酵菌种GW04进行粪污堆积发酵试验，发现腐熟后的粪肥中有机质、氮素含量显著高于其他四种菌种，这一结果与张雪辰[6]、李敬波[7]相似，表明本文所述筛选方法筛选到的高温发酵菌剂对熟化后的粪肥含氮量有明显提升作用，保氮效果好，一定程度上减少N损失，减轻N素外排造成的环境胁迫。

参考文献

[1]王琦，陈五岭.牛粪堆肥高效降解菌的筛选及复合微生物菌剂的制备[J].安徽农业科学，2008，36（35）：15653-15655.

[2]勾长龙，高云航，刘淑霞，等.微生物菌剂对堆肥发酵影响的研究进展[J].湖北农业科学，2013，52（6）：1244-1247.

[3]岳林芳，乔健敏，成立新，等.微生物对堆肥发酵进程影响的研究进展[J].畜牧与饲料科学，2020，41（4）：49-.

[4]卢洋洋，杨硕，张玉，等.不同复合微生物菌剂对牛粪堆肥效果的影响[J].家畜生态学报，2021，42（2）：43-49.

[5]王建才，朱荣生，刘兴华，等.微生物菌剂对猪粪堆肥中细菌群落结构的影响[J].应用生态学报，2020，31（7）：2449-2456.

[6]张雪辰，邓双，王旭东.快腐剂对畜禽粪便堆肥过程中腐熟度的影响[J].环境工程学报，2015，9（2）：888-4.

[7]李敬波，王熙涛，王丽丽，等.接种复合嗜热菌剂对牛粪堆肥的影响[J].饲料与畜牧，2014，（6）：47-51.