外源性DNA残留量测定法qPCR法

1原理

实时定量PCR (qPCR)扩增分2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数 平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反 应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长 速度变慢，反应进入平台期。

反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增 加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环 数，即6。CT值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度 高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物，产生高过背景的荧光信号，因 此，反应就有一个小或早出现的CT ;相反，如果模板初始浓度低，需要 较多的扩增 循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的CT。两者之间尖系的 建立是qPCR用于定量的依据。

2主要仪器

表2仪器信息表

名称 实时定暈PCR仪 厂家 Bio-Rad 型号 CFX Co rm ect 3主要试剂

表3试剂信息表

名称 厂家 规格 1) Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle; 2) Bin di ng Solutio n,1 empty bottle; 3) Wash Buffer Concentrate, 2 bottles, 26 ml/bottle; 残留DNA样品制备试 剂盒 ABI 4) Elution Buffer; 1 bottle, 25ml; 5) Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml; 6) Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube; 7) Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml; 8) Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml,0.5ml; Glycoge n, 2 tubes,5mg/ml,1 .Oml/tube. 1) DNA Control」bottle,40 d; 2) DNA Dilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml; 残留DNA定暈检测试 剂盒(CHO) ABI 3) 2 XEn viro nmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube; 4) 10 XDNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300 d; 5) Negative Con trol, 1 tube,1.0ml. 4溶液配制

4.1蛋白酶K混合液(新配)

1 react ion (100 讪/sample) Prote in ase K Prote in ase K Buffer 10p 60 p 10 react ion (100 p/sample) 100p 600 p 4.2裂解混合液（新配）

试齐u Glycogen f5mg/ml) tRNA (10mg/ml) Lysis Buffer 合计 体积（P） 180 4 7600 7784 4.3 DNA标准品稀释

Tube label Dilutio n DNA Co ntrol 10 p DNA Control+990 pDDB 50 pSD1+450 pDDB 50 pSD2+450 p DDB 50 pSD3+450 p DDB 50 pSD4+450 p DDB 50 pSD5+450 p DDB DDB pg/p 30000 300 30 3 0.3 0.03 0.003 0 pg/ reacti on 300000 3000 300 30 3 0.3 0.03 0 SD1 SD2 SD3 SD4 SD5 SD6 NTC 注：DNA标准品溶液4C放置保存1天…2 0 C放置保存1周。

5测定方法

5・1样品处理5.1.1除蛋白

1 ）在2ml离心管中加入100 pl样品； 2） 每100p的样品中加入70p的蛋白酶K混合液，混合均匀，56C水浴

30min ；

3） 每100 p的样品中加入360 p的裂解液，室温裂解2小时以上。 5.1.2 DNA的纯化

1）磁珠使用前于37匸温浴10min,高速涡旋，彻底悬浮磁珠； 2 ）每100 p的样品加入30 p的磁珠悬浮液；

3） 每100 p的样品加入300 p的Binding Solution、涡旋混合5min ； 4） 12000r/min离心30sec将离心管放置于磁力架上，静置5min直至溶液 清

澈，弃上清；

5） 从磁力架上取下离心管，加入300 p的Wash Buffer，涡旋混合5 sec； 6） 12000r/min离心30sec,将离心管放置于磁力架上，静置2min,弃上清； 7） 重复步骤6） 1次，打开离心管的盖子，室温下风干；

8） 加入50 p的Elution Buffer，高速涡旋10 sec, 70C处理10min,在温浴 过 程

中，涡旋2〜3次；

9） 12000r/min离心30sec,将离心管放置于磁力架上，静置2min，将含有 洗

脫DNA的液体转移到新的1 -5ml的离心管中，用于进行qPCR反应。

5.2 PCR反应体系

1 )标准品、NTC和样品均做2个复孔; 2)反应母液用量按表4进行计算：

表4PCR反应体系

Volume for 1 30- d reaction Volume for 36 30- d react ion Kit Reage nts Negative Con trol 10 XDNA Resl-Time PCR Assay Mix 2 Environmental Master Mix DNA template 合计 (d) 2 3 15 10 30 (d) 72 108 540 N/A 720 5.3 PCR仪运行程序设置 5.3.1 PCR反应体系

1 )

标准品、NTC和样品均做2个复孔;

2 ) 反应母液用量按表5进行计算：

表5PCR反应体系

Volume for 1 30- d react ion Kit Reage nts Negative Con trol 10 >DNA Resl-Time PCR Assay Mix 2 Environmental Master Mix DNA template 合计 (d) 2 3 15 10 30 Volume for 36 30・ d reaction (d) 72 108 540 N/A 720 5.2.2 PCR仪运行程序设置

1)

荧光基团选择FAM ；

2) 96孔反应模块设置见下表，样品根据实际数量依次设置:

1 A B C D E F SD1 SD2 SD3 SD4 SD5 SD6 2 SD1 SD2 SD3 3 样品 1 样品 2 样品 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 样品 1 样品 2 样品 3 SD4 SD5 SD6 G NTC NTC H 3） PCR反应条件设置 步骤 1 2 3 温度 95 C 95 C 60 C 时 间（min:sec） 10:00 0:10 0:30 4 GOTO 2 , 39 循环

4）运行上述设置的程序

6接受标准

1） 标准曲线：扩增效率（E） ： 90%〜130%;矗〉0.980斜率（27-3.60

2 ）样品数据：2个复孔测定值SQ的CVC 20%。 7结果计算与判断

外源性DNA残留量（pg/ml） =SQ<50, SQ代表测定平均值。

根据检测样品的蛋白质浓度，得出样品中每剂量所残留的外源性Slope）：DNA量・